國家藥監(jiān)局
關(guān)于發(fā)布腫瘤相關(guān)突變基因檢測試劑和CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測試劑
2項注冊技術(shù)審查指導原則的通告

（2019年 第83號）

為加強醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊工作的監(jiān)督和指導，進一步提高注冊審查質(zhì)量，國家藥品監(jiān)督管理局組織制定了《腫瘤相關(guān)突變基因檢測試劑（高通量測序法）性能評價通用注冊技術(shù)審查指導原則》和《CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則》，現(xiàn)予發(fā)布。

特此通告。

國家藥監(jiān)局2019年11月12日

【佳學基因檢測】CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導原則是對CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，也不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

藥物代謝酶在藥物體內(nèi)代謝過程中起著重要作用，其活性強弱是藥物代謝速率的重要影響因素，直接決定了藥物作用的強度和持久性。人體內(nèi)的藥物代謝酶主要有細胞色素P450（CYP450）同工酶和N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（NAT）等。CYP2C19酶是一種重要的CYP450同工酶，臨床以CYP2C19酶為主要代謝酶的藥物包括抗血小板藥物（如：氯吡格雷）和質(zhì)子泵抑制劑等。氯吡格雷是一種抗血小板藥物，廣泛用于：急性冠脈綜合征（ACS）患者，包括非ST段抬高性ACS（不穩(wěn)定性心絞痛UA或非Q波心肌梗死）和ST段抬高性心肌梗死（NSTEMI）患者，其中，非ST段抬高性ACS包括經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后置入支架的患者；外周動脈性疾病患者；近期心肌梗死或近期缺血性卒中患者。氯吡格雷作為一種前體藥物，本身并無藥理活性，主要經(jīng)CYP2C19酶代謝活化，產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物，后者與血小板表面的P2Y12受體不可逆結(jié)合，抑制血小板聚集，干擾ADP介導的血小板活化，發(fā)揮抗血小板效應(yīng)。

CYP2C19酶的編碼基因為CYP2C19基因，位于人類10號染色體上。CYP2C19基因含有42個等位基因，CYP2C19*1為野生型等位基因，其編碼的酶具有正?；钚?。CYP2C19*2（rs4244285，c.681G>A）和CYP2C19*3（rs4986893，c.636G>A）編碼的CYP2C19酶活性降低，是中國人群中存在的2種主要的等位基因，在中國人群的發(fā)生頻率分別為23.1%～35%和2%～7%。CYP2C19*17（rs12248560,c.-806C>T）編碼的CYP2C19酶活性增強，在中國人群的發(fā)生頻率約為0.5%～4%。除CYP2C19*2/*3/*17之外，可能影響CYP2C19酶活性的CYP2C19等位基因還包括CYP2C19*4～CYP2C19*8等，但這些等位基因在中國人群的發(fā)生頻率低，其功能與臨床意義有待進一步研究。

CYP2C19基因的遺傳變異導致CYP2C19酶活性的個體差異，使人群出現(xiàn)超快代謝者（UM）、快代謝者（EM）、中間代謝者（IM）和慢代謝者（PM）4種表型。CYP2C19 UM患者應(yīng)用常規(guī)劑量的氯吡格雷后體內(nèi)生成的活性代謝產(chǎn)物增多，對血小板的抑制作用升高，抗血小板功能增強，出血風險增大。而CYP2C19 PM患者應(yīng)用常規(guī)劑量的氯吡格雷后體內(nèi)生成的活性代謝產(chǎn)物減少，對血小板的抑制作用下降，抗血小板功能減弱，血栓風險增大。UM個體的基因型可為CYP2C19*17/*17純合型或CYP2C19*1/*17雜合型；EM個體的基因型可為CYP2C19*1/*1純合型；IM個體的基因型可為CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*17或CYP2C19*3/*17雜合型；PM個體的基因型可為CYP2C19*2/*3、CYP2C19*2/*2和CYP2C19*3/*3雜合型或純合型。

通過CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測，可將服藥人群分為上述4類氯吡格雷代謝患者，從而用于氯吡格雷的用藥指導。美國FDA在氯吡格雷藥物說明書中建議：對于CYP2C19 PM患者，可考慮使用其他血小板P2Y12抑制劑。遺傳藥理學知識庫以及臨床遺傳藥理學實施聯(lián)盟（CPIC）發(fā)布的CYP2C19基因型和氯吡格雷用藥指導文件建議：對于CYP2C19 PM患者和IM患者，可選用其它抗血小板藥物（如：普拉格雷或替格瑞洛）進行治療。2015年，原國家衛(wèi)生計生委發(fā)布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術(shù)指南（試行）》也建議：對于CYP2C19 PM患者的抗血小板治療，可增加氯吡格雷的劑量或選用其他不經(jīng)CYP2C19代謝的抗血小板藥物（如替格瑞洛）等。

然而，對于哪些氯吡格雷服藥人群需進行CYP2C19基因型檢測，國內(nèi)外尚無統(tǒng)一意見。2013年發(fā)布的《抗血小板治療中國專家共識》建議：CYP2C19基因型檢測臨床應(yīng)用價值有限，不推薦常規(guī)進行。CPIC在隨后發(fā)布的CYP2C19基因型和氯吡格雷用藥指導文件中建議：基于CYP2C19基因型的氯吡格雷抗血小板治療主要用于進行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療的急性冠脈綜合征患者（簡稱為ACS/PCI患者），尚無證據(jù)表明CYP2C19基因型可用于指導氯吡格雷在其他患者中的抗血小板治療。2014年發(fā)布的《抗血小板藥物治療反應(yīng)多樣性臨床檢測和處理的中國專家建議》建議：不推薦常規(guī)進行CYP2C19基因型檢測，僅對PCI術(shù)后血栓高危、且計劃調(diào)整P2Y12抑制劑治療方案的患者，推薦進行血小板功能檢測和CYP2C19基因型檢測。2017年發(fā)布的《基因多態(tài)性與抗栓藥物臨床應(yīng)用專家建議》建議：CYP2C19基因型檢測主要對缺血高風險/出血高風險患者選用P2Y12抑制劑有參考價值。綜合考慮上述意見并結(jié)合中國實際情況，建議將本指導原則的預期適用人群限定為：

正在服用或?qū)⒁寐冗粮窭走M行抗血小板治療的冠心病患者，主要為急性冠脈綜合征（ACS）且進行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）的患者（ACS/PCI患者）、PCI術(shù)后血栓高危且計劃調(diào)整P2Y12抑制劑治療方案的患者、缺血高風險或出血高風險患者等。其中，PCI術(shù)后血栓高?；颊咭约叭毖唢L險/出血高風險患者的人群限定可參考相關(guān)指南。

本指導原則所述CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測試劑是指：利用分子生物學檢測技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）等，以CYP2C19基因特定序列為檢測靶標，對接受氯吡格雷治療患者的外周靜脈全血或口腔拭子等樣本基因組DNA中的CYP2C19基因多態(tài)性進行體外定性檢測的試劑，用于氯吡格雷的用藥指導。

本指導原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對于其他分子生物學檢測技術(shù)，可能部分要求不有效適用或本文所述技術(shù)指標不夠更多，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進行或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。

本指導原則僅對用于氯吡格雷用藥指導的CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測試劑的相關(guān)要求進行了說明，由于CYP2C19參與了多種不同藥物的代謝，對用于其他藥物用藥指導的CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測試劑，可能部分要求不有效適用或本文所述技術(shù)指標不夠更多，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進行修訂或補充其他的評價和驗證。

本指導原則適用于進行新穎注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及國內(nèi)外同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中，同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學、檢驗原理、賊低檢測限及被測靶標（基因多態(tài)性位點）等方面詳細說明申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。除此之外，還應(yīng)說明被測靶標純合型和雜合型在中國人群的發(fā)生頻率。

若被測靶標為新的多態(tài)性位點，申請人還應(yīng)提交支持資料，以證明：1.攜帶新位點等位基因所編碼的CYP2C19酶對氯吡格雷具有預期的代謝活性；2.攜帶新位點等位基因的患者，其血小板功能具有預期的差異；3.接受氯吡格雷治療且攜帶新位點等位基因的患者表現(xiàn)出預期的主要不良心血管事件；4.根據(jù)基因型調(diào)整抗血小板治療方案后，攜帶新位點等位基因的患者預后獲得改善。上述資料應(yīng)為體內(nèi)臨床試驗數(shù)據(jù)，如：在預期適用人群體內(nèi)進行的酶速率研究試驗，基因型與預期適用人群的主要不良心血管事件關(guān)聯(lián)試驗，基因型導向的抗血小板治療試驗等。上述資料必須包括基于中國人群的充分的臨床數(shù)據(jù)。如新位點可用于氯吡格雷用藥指導的結(jié)論已獲得行業(yè)承認，應(yīng)同時提交證明其獲得行業(yè)承認的支持資料。

綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號），以下簡稱《44號公告》的要求。

（二）主要原材料的研究資料

CYP2C19基因多態(tài)性檢測試劑主要原材料研究資料包括主要反應(yīng)成分、質(zhì)控品及企業(yè)參考品的研究資料。

1. 此類產(chǎn)品的主要反應(yīng)成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測所需引物、探針、酶、dNTP、反應(yīng)緩沖液等。申請人應(yīng)提交相關(guān)原材料的選擇、制備和質(zhì)量標準研究資料。如為申請人自制，應(yīng)提交詳細的工藝穩(wěn)定性研究資料；如為外購，還應(yīng)提交供應(yīng)商篩選資料以及供應(yīng)商提供的原材料質(zhì)量檢定報告。

1.1 核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗證資料。

1.2 引物、探針

本文所述CYP2C19基因多態(tài)性檢測一般針對等位基因CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17。申請人應(yīng)詳述引物、探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應(yīng)情況。建議設(shè)計兩套或多套引物探針以供篩選，針對待測位點的檢測靈敏度和特異性等進行評價，選擇賊佳設(shè)計，并提交詳細的篩選研究數(shù)據(jù)。同時應(yīng)針對引物、探針核酸序列及檢測靶序列進行同源性比對，如有同源序列應(yīng)著重評價是否會有交叉反應(yīng)。

申請人應(yīng)針對選定的引物、探針原材料進行質(zhì)量評價，一般包括：分子量、純度（HPLC等）、濃度、探針熒光標記基團的激發(fā)波長和發(fā)射波長，以及功能性試驗等，并依據(jù)評價結(jié)果建立合理的質(zhì)量標準。

1.3酶

CYP2C19基因多態(tài)性檢測試劑可能涉及到的酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）。申請人應(yīng)針對各種酶的活性進行驗證，提交功能性試驗資料，并確定酶的質(zhì)量標準。

DNA聚合酶應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應(yīng)具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

1.4脫氧三磷酸核苷（dNTP）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應(yīng)提交對其純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗證資料，以及功能性試驗資料，并確定質(zhì)量標準。

2.質(zhì)控品

試劑盒的質(zhì)控體系通過設(shè)置各種試劑盒質(zhì)控品來實現(xiàn)。

CYP2C19基因多態(tài)性檢測試劑的質(zhì)控品可分別設(shè)置野生型、雜合型及純合突變型DNA樣品（至少包含常見的多態(tài)性位點），同時設(shè)置不含待測靶序列的空白質(zhì)控品用于交叉污染的質(zhì)控；亦可直接采用常見多態(tài)性位點的雜合型樣品及空白質(zhì)控品進行質(zhì)量控制。

對于此類產(chǎn)品，一般情況下，反應(yīng)體系中野生型序列和突變型序列均有陽性反應(yīng)，可以對管內(nèi)抑制導致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，則試劑盒中可不另外設(shè)置內(nèi)標對照；否則，應(yīng)另外設(shè)置內(nèi)標對照。

質(zhì)控體系應(yīng)能夠?qū)z測全過程進行有效的質(zhì)量控制，包括試劑及儀器性能、可能的擴增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染等因素造成的假陰性或假陽性結(jié)果。質(zhì)控品可采用質(zhì)?；蚺R床樣本的核酸提取液等?？瞻踪|(zhì)控品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。申請人應(yīng)針對質(zhì)控品原料選擇、制備、定值過程等提供詳細的研究數(shù)據(jù)，并對質(zhì)控品的檢測結(jié)果做出明確的范圍要求。

3.企業(yè)參考品

企業(yè)參考品主要包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、精密度參考品等。申請人應(yīng)提交有關(guān)企業(yè)參考品原料選擇、制備方法、基因序列確認及檢驗標準的研究資料，包括所用到的參考方法等。

3.1陽性參考品：可采用臨床樣本或其核酸提取液，樣本類型與待測樣本一致。應(yīng)至少包含野生型和所有多態(tài)性位點的雜合型樣本，同時盡量納入純合突變型樣本。對于某些稀有基因型，需要時也可采用細胞系代替。

3.2陰性參考品：應(yīng)考慮檢測特異性的評價，納入同源序列交叉反應(yīng)樣本、干擾樣本等。

3.3檢測限參考品可選擇賊低檢測限濃度（例如：95%檢出率水平）或接近賊低檢測限濃度（例如100%檢出率水平）的臨床樣本或其核酸提取液，至少包含所有多態(tài)性位點的雜合型樣本。

3.4精密度參考品應(yīng)至少包括所有多態(tài)性位點的低濃度雜合突變型臨床樣本或其核酸提取液。

如CYP2C19基因多態(tài)性檢測試劑已有國家參考品，企業(yè)參考品的要求應(yīng)不低于國家參考品要求。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTP濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標記等工藝過程的描述及確定依據(jù)。生產(chǎn)過程應(yīng)對關(guān)鍵參數(shù)進行有效控制，可采用流程圖方式描述生產(chǎn)工藝，標明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細說明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標準。

反應(yīng)體系研究指賊佳反應(yīng)條件的選擇確定過程，包括樣本采集預處理、樣本保存、樣本用量、試劑用量、核酸提取純化步驟（如有）、PCR反應(yīng)條件、閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）等的確定。

不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。

（四）分析性能評估資料

申請人應(yīng)針對下述各項分析性能提交詳細的評估資料，包括試驗方法、試驗樣本（類型、來源、數(shù)量、處理方法、基因型和濃度確認）、試驗可接受標準、統(tǒng)計方法、試驗數(shù)據(jù)及結(jié)論等。有關(guān)背景信息也應(yīng)在資料中有所體現(xiàn)，包括實驗地點、適用儀器、試劑規(guī)格、批號等。分析性能評估的實驗方法可以參考相關(guān)國內(nèi)或國外有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導原則進行。

每項性能評估應(yīng)盡量采用與適用樣本類型一致的臨床樣本，對于某些稀有基因型也可采用細胞系等。

如產(chǎn)品適用樣本類型不止一種，申請人應(yīng)針對不同樣本類型分別完成性能評估。

1. 核酸提取/純化性能（如有）

在進行靶核酸檢測前，應(yīng)有適當?shù)暮怂崽崛?純化步驟。該步驟除賊大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸提取/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)結(jié)合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸提取/純化方法的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，并評價該方法能否滿足CYP2C19基因多態(tài)性檢測試劑的要求，提供詳細的評價資料。

2. 檢測正確性

建議采用若干份臨床樣本驗證CYP2C19基因多態(tài)性試劑的檢測正確性，樣本類型與產(chǎn)品適用范圍一致；樣本應(yīng)涵蓋野生型和所有多態(tài)性位點的雜合突變、純合突變情況，并包含不同基因組DNA濃度。對于某些基因型樣本較為稀有的情況，亦可采用細胞系代替。

3. 檢測限和可報告范圍

CYP2C19基因多態(tài)性檢測試劑的賊低檢測限可定義為：在滿足一定的檢測正確性和精密度的條件下，能夠檢出目標基因的賊低人基因組DNA濃度。檢測限評價建議采用臨床樣本或細胞系，并至少包含所有多態(tài)性位點的雜合突變型。

可采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進行多次重復檢測，確定適當檢出率水平（如：95%）下的賊低人基因組DNA濃度，即為賊低檢測限。系列稀釋度應(yīng)能夠覆蓋大部分檢出概率區(qū)間（0～100%），可根據(jù)各濃度梯度檢測結(jié)果直接判定，也可通過概率計算或其他適當方法進行測算。

同時，申請人亦應(yīng)評價CYP2C19基因多態(tài)性試劑可正確檢出的人基因組DNA濃度上限，即適當檢出率水平下的賊高人基因組DNA濃度。

4. 分析特異性

4.1 應(yīng)針對同源性序列（例如CYP2C19的其他突變序列、CYP2C9基因序列等）進行交叉反應(yīng)驗證，說明交叉反應(yīng)樣本的制備方法、核酸序列確認方法，提交詳細的驗證資料。

4.2 應(yīng)針對可能的內(nèi)源和外源性干擾物進行干擾試驗研究。干擾物的選擇與所用樣本類型有關(guān)，例如：全血樣本，內(nèi)源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑、常用藥物等；對于口腔拭子樣本，干擾物需考慮全血、口腔定植菌以及口腔可能接觸到的抗菌漱口液、牙膏、食物、藥物、煙草等。

干擾試驗可通過在臨床樣本中人工添加干擾物質(zhì)的方式，評價干擾物質(zhì)對目標基因檢測的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進行干擾試驗評價。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在賊大濃度（“賊差條件”）條件下進行評價；如有干擾，應(yīng)確定不產(chǎn)生干擾的賊高濃度。

5. 精密度

精密度評價應(yīng)采用臨床樣本進行試驗，試驗操作有效按照說明書執(zhí)行，包含核酸提取/純化等樣本處理步驟。樣本應(yīng)至少涵蓋所有多態(tài)性位點的雜合突變型。

精密度評價需滿足如下要求：

5.1對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑（包括核酸提取/純化組分）本身外，還包括分析儀、操作者、地點、時間、檢測輪次、試劑批次等。

5.2設(shè)定合理的精密度評價周期，對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間重復性進行評價。

5.3用于精密度評價的臨床樣本應(yīng)根據(jù)可報告范圍的基因組DNA濃度至少設(shè)置低濃度和中/高濃度水平。

5.4精密度指標可設(shè)置為檢測成功率等，申請人應(yīng)對精密度指標評價標準做出合理要求。

精密度評價資料應(yīng)詳述試驗設(shè)計、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析及試驗結(jié)果，列出有關(guān)試劑、儀器、實驗室、人員、樣本的相關(guān)信息。

（五）陽性判斷值確定資料

對于此類試劑，陽性判斷值即為能夠獲得理想的檢測正確性的臨界值（Cut-off）。建議納入一定數(shù)量的臨床樣本，涵蓋野生型和所有多態(tài)性位點的突變型，采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進行研究。相關(guān)資料中應(yīng)詳述試驗方案、樣本來源、樣本量、樣本入組標準及試驗結(jié)果等。

應(yīng)針對不同樣本類型（如有）分別進行陽性判斷值研究，明確是否有差異。

如果試劑判讀存在灰區(qū)，應(yīng)解釋說明灰區(qū)范圍的確定方法。

對于某些檢測方法學，陽性判斷值研究可能不適用，申請人應(yīng)說明理由。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要包括申報產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究和適用樣本的穩(wěn)定性研究兩部分。前者主要包括申報產(chǎn)品的實時穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、復溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制的研究等；后者則是指適用樣本的保存條件、保存時間等方面的研究，如果包括多種樣本類型，則需分別完成相關(guān)研究。

申報產(chǎn)品實時穩(wěn)定性研究中，應(yīng)采用至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后，選取多個時間點進行產(chǎn)品性能評價，從而確定產(chǎn)品保存條件和有效期。

樣本穩(wěn)定性研究中，如核酸提取液不一定立即進行檢測，則還需對核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進行研究。

申請人應(yīng)提交有關(guān)穩(wěn)定性研究方案的確定依據(jù)、具體的試驗方法及詳細的研究數(shù)據(jù)、結(jié)論。

（七）臨床試驗

應(yīng)滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的要求，下面僅說明本類試劑臨床試驗中應(yīng)關(guān)注的重點問題。

1. 臨床試驗機構(gòu)

申請人應(yīng)當選定不少于3家（含3家）臨床試驗機構(gòu)，按照相關(guān)規(guī)定開展臨床試驗。申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點及預期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學背景等因素選擇臨床試驗機構(gòu)。

1. 臨床試驗人群

正在服用或?qū)⒁寐冗粮窭走M行抗血小板治療的冠心病患者，主要為急性冠脈綜合征（ACS）且進行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）的患者（ACS/PCI患者）、PCI術(shù)后血栓高危且計劃調(diào)整P2Y12抑制劑治療方案的患者、缺血高風險或出血高風險患者等。其中，PCI術(shù)后血栓高?；颊咭约叭毖唢L險/出血高風險患者的人群限定可參考相關(guān)指南。

1. 臨床樣本

應(yīng)為臨床原始樣本，如靜脈抗凝全血等，不應(yīng)直接采用提取的基因組DNA進行試驗。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)同時滿足申報產(chǎn)品說明書以及對比試劑說明書（如適用）的相關(guān)要求。

1. 臨床試驗樣本量

如申報產(chǎn)品同時適用于靜脈全血或口腔拭子等不同基質(zhì)的樣本類型，則每種樣本類型的例數(shù)應(yīng)分別滿足法規(guī)要求。

5. 臨床檢測正確性驗證

5.1 對比試劑

5.1.1已有同類產(chǎn)品上市的申報產(chǎn)品

對于已批準的CYP2C19*2（rs4244285，c.681G>A）、CYP2C19*3（rs4986893，c.636G>A）以及CYP2C19*17（rs12248560,c.-806C>T）多態(tài)性位點，可選擇已上市同類試劑作為對比試劑。

5.1.2 無同類產(chǎn)品上市的申報產(chǎn)品

對于新的多態(tài)性位點，可選擇基因測序作為對比方法。

5.1.3基因測序

應(yīng)提交臨床試驗機構(gòu)和測序機構(gòu)簽章的委托測序協(xié)議。應(yīng)對選用的測序方法做詳細介紹，應(yīng)提供以下關(guān)于測序的詳細試驗資料，該部分資料需由臨床試驗機構(gòu)簽章。

5.1.3.1測序原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關(guān)信息。

5.1.3.2測序方法所用引物信息，如核酸序列、分子量、純度、功能性實驗等資料。引物設(shè)計應(yīng)涵蓋申報產(chǎn)品擴增的被測靶標。

5.1.3.3 測序方法的性能驗證，尤其是賊低檢測限的確認，建議將所選測序方法與申報產(chǎn)品的性能進行比對分析。

5.1.3.4 測序方法應(yīng)建立合理的陽性和陰性質(zhì)控，以對臨床樣本的檢測結(jié)果進行質(zhì)量控制。

5.1.3.5 提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。

6. 氯吡格雷指導用藥臨床有效性的驗證

6.1 已有同類產(chǎn)品上市的申報產(chǎn)品

已批準的CYP2C19*2（rs4244285，c.681G>A）、CYP2C19*3（rs4986893，c.636G>A）以及CYP2C19*17（rs12248560,c.-806C>T）多態(tài)性位點，無需進行該部分驗證。

6.2 無同類產(chǎn)品上市的申報產(chǎn)品

6.2.1如新多態(tài)性位點用于氯吡格雷用藥指導已獲行業(yè)承認（包括：CPIC、國內(nèi)相關(guān)指南或?qū)＜夜沧R、相關(guān)藥物說明書以及臨床應(yīng)用等的承認），且有充分的中國人群的體內(nèi)臨床數(shù)據(jù)，無需進行該部分驗證。

6.2.2如新多態(tài)性位點用于氯吡格雷用藥指導未獲行業(yè)承認，應(yīng)提交基于中國人群的充分的體內(nèi)臨床數(shù)據(jù)，包括但不限于：

6.2.2.1新的多態(tài)性位點等位基因編碼的CYP2C19酶對氯吡格雷的代謝動力學驗證資料。

6.2.2.2血小板功能檢測。比較不同基因型患者血小板功能的差異。

6.2.2.3基因型與主要不良心血管事件關(guān)聯(lián)性的體內(nèi)臨床試驗。

6.2.2.4基因型可指導氯吡格雷用藥的有效性證據(jù)。

6.2.3 需要強調(diào)的是，對于6.2所述申報產(chǎn)品（包括6.2.1和6.2.2），申請人應(yīng)在臨床試驗資料部分提交聲稱的新多態(tài)性位點已獲行業(yè)承認的相關(guān)資料以及基于中國人群的充分的體內(nèi)臨床數(shù)據(jù)等，以證明申報產(chǎn)品可指導氯吡格雷用藥。

7. 臨床試驗方法、數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析

7.1應(yīng)在臨床試驗方案或報告中描述申報產(chǎn)品和對比試劑/方法的試驗方法。

7.2臨床試驗原始數(shù)據(jù)應(yīng)以列表方式表示，包括申報產(chǎn)品的結(jié)果、對比試劑/方法的結(jié)果、臨床診斷、年齡、性別以及是否進行PCI等。

7.3應(yīng)總結(jié)野生型、各多態(tài)性位點雜合型和純合突變型的例數(shù)，以交叉四格表分別總結(jié)兩種試劑對各多態(tài)性位點的定性檢測結(jié)果，并分別計算各多態(tài)性位點基因型的陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%置信區(qū)間，對定性結(jié)果分別進行四格表卡方或kappa檢驗，以驗證兩種試劑檢測結(jié)果的一致性。

7.4 結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用合理方法進行復核，并對差異原因進行分析。如無需復核，應(yīng)說明理由。

8. 臨床試驗方案

各臨床試驗機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且盡力做到在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床試驗機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導外，不得隨意干涉實驗進程。

試驗方案應(yīng)確定嚴格的入選/排除標準，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程和結(jié)果判定時應(yīng)采用盲法以盡力做到試驗結(jié)果的客觀性。各臨床試驗機構(gòu)選用的對比試劑/方法應(yīng)保持一致，以便進行合理的統(tǒng)計學分析。另外，申報產(chǎn)品的樣本類型不應(yīng)超越對比試劑/方法對樣本類型的要求。

9. 臨床試驗報告

應(yīng)對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》《44號公告》和《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的相關(guān)要求。該類產(chǎn)品作為三類體外診斷試劑，應(yīng)將主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求等內(nèi)容作為附錄附于技術(shù)要求正文后。

如果申報產(chǎn)品已有相應(yīng)的國家/行業(yè)標準發(fā)布，則企業(yè)標準的要求不得低于上述標準要求。

（九）產(chǎn)品檢驗報告

根據(jù)《辦法》的要求，第三類體外診斷試劑申請注冊時應(yīng)提交連續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的檢驗報告。如有國家標準品/參考品的檢驗項目，應(yīng)在產(chǎn)品檢驗時采用。

（十）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書應(yīng)滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）的要求，產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致。下面對CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行闡述。

1.【預期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測人體xx樣本中的yy基因多態(tài)性，可檢測的多態(tài)性類型包括aa，本產(chǎn)品用于氯吡格雷的用藥指導。本產(chǎn)品不能預測患者對氯吡格雷的應(yīng)答情況，僅能輔助醫(yī)生確定氯吡格雷治療策略。本產(chǎn)品檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者是否用藥的先進依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、療效及其他實驗室檢測指標等對本產(chǎn)品的檢測結(jié)果進行綜合判斷。

1.2介紹被測靶標（基因多態(tài)性位點），明確各多態(tài)性雜合型和純合型的臨床發(fā)生頻率，明確可進行氯吡格雷用藥指導的適用人群，明確不同基因型與氯吡格雷的關(guān)系。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關(guān)信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)過驗證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及產(chǎn)品貨號和醫(yī)療器械備案號（如有）等詳細信息。

3.【檢驗原理】

3.1對試劑盒的被測靶標進行詳細描述（基因位置、多態(tài)性位點及相關(guān)特征等），對試劑盒所用探針、引物、多態(tài)性的判定終點等進行詳細的介紹；對不同樣本反應(yīng)管組合、質(zhì)控品設(shè)置及熒光信號檢測原理等進行介紹。

3.2試劑盒技術(shù)原理的詳細介紹，建議結(jié)合適當圖示進行說明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對其作用機理進行適當介紹。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性等，應(yīng)明確具體的儲存條件及有效期等信息。

5.【樣本要求】

樣本的采集、處理、運送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化前的處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限（短期和長期）以及運送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復至室溫，凍融次數(shù)的限制等。

6.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導用戶操作。

7.【檢驗方法】

詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1實驗條件：實驗室分區(qū)、實驗環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法和注意事項。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項（如適用），對核酸提取純化環(huán)節(jié)進行合理的質(zhì)量控制，明確提取核酸的濃度純度等質(zhì)量要求。

7.4擴增反應(yīng)前準備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動化檢測程序及相關(guān)注意事項。

7.6儀器設(shè)置（如適用）：特殊參數(shù)、探針的熒光素標記情況、對待測多態(tài)性及其他質(zhì)控品的熒光通道選擇等。

8.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合質(zhì)控品、樣本管檢測結(jié)果以及多態(tài)性類型與氯吡格雷表型之間的關(guān)系，以列表形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應(yīng)的解釋。如存在檢測灰區(qū)，應(yīng)詳述對于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

9.【檢驗方法的局限性】

9.1申報產(chǎn)品僅對下述多態(tài)性類型xx進行了驗證。

9.2有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運送及處理或核酸過度降解均有可能導致假陰性結(jié)果。

9.2.2未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導致假陰性結(jié)果（如有）。

10.【產(chǎn)品性能指標】簡述以下性能指標：

10.1賊低檢測限：簡單介紹賊低檢測限的確定方法，并明確賊低檢測限結(jié)果。

10.2陽性/陰性參考品符合率。

10.3精密度：簡單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結(jié)果。

10.4分析特異性

10.4.1交叉反應(yīng)驗證：同源性序列等交叉反應(yīng)驗證。

10.4.2干擾物質(zhì)驗證：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。

10.5對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

11.【注意事項】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

11.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實驗室應(yīng)嚴格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

三、起草單位

國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心。

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