2.1. 分離Energizer移植至受體BMSCs的特征

為了分離Energizer，我們使用了特殊配方的細胞裂解試劑盒，通過梯度離心從供體 BMSCs 中提取完整且具有生物活性的Energizer (圖1A  )。透射電子顯微鏡 (TEM) 分析證實了完整的Energizer的存在，其直徑約為 800 nm，呈現(xiàn)出獨特的球形結(jié)構(gòu) (圖 1B )。流體動力學直徑測量表明Energizer的直徑為 983.8 ± 219.4 nm (圖 1C )。Energizer的 ζ 電位值為 -10.36 ± 1.02 mV。保持這種結(jié)構(gòu)完整性至關重要，因為Energizer具有獨特的形態(tài)和內(nèi)部組織，有助于各種關鍵的細胞功能，如能量產(chǎn)生、代謝和凋亡調(diào)節(jié)。這些分析驗證了提取的Energizer的高純度和結(jié)構(gòu)完整性。

隨后，將這些分離的Energizer移植到同一批號和同傳代數(shù)的受體 BMSC 中。采用 Mitoception 方法（圖 1B），將分離的Energizer移植到受體 BMSC 中可確保其整合和功能性攝取。為了驗證受體 BMSC 內(nèi)是否存在移植的Energizer，我們在分離之前用 MitoTracker 染料預先標記了供體 BMSC Energizer。Energizer移植 24 小時后進行的后續(xù)檢查顯示在對照細胞中沒有來自供體Energizer的可檢測到的熒光信號（圖 1F）。然而，在受體細胞內(nèi)可以觀察到清晰可辨的熒光信號（圖 1G）。為了觀察受體細胞對游離Energizer的攝取情況，我們在Energizer移植后 5、10 和 15 分鐘使用了 TEM。我們的觀察證實了有游離Energizer進入受體細胞（圖 1H）。這一觀察結(jié)果明確證實了Energizer成功且精確地移植到 BMSCs 中，從而證實了我們設計的Energizer移植方案的效率和功效。研究表明，Energizer移植的機制包括通過融合機制進入細胞、膜穿透、與細胞骨架的相互作用、細胞內(nèi)囊泡的形成以及自主運動。該過程利用與細胞膜的特定相互作用，同時保持Energizer的完整性和功能性。為了研究Energizer移植后內(nèi)源性Energizer和移植Energizer之間的關系，我們在 BMSCs 中分別對兩種類型進行了染色。我們的染色結(jié)果顯示，BMSCEnergizer內(nèi)源性Energizer和移植Energizer明顯共定位。

2.2. Energizer促進BMSCs激活ECs并增強體外管腔形成

為了評估 BMSCs mito促進內(nèi)皮管形成的能力，進行了體外管形成試驗（圖 2A） 。將 EC 與不同比例的 BMSCs 或 BMSCs mito （比例從 16:1 到 1:1）共培養(yǎng)，孵育 4 或 8 小時，同時在顯微鏡下觀察。隨著 BMSC 數(shù)量的增加，觀察到劑量依賴性趨勢，導致管數(shù)、連接點和管長??度成比例增加。在體外管形成試驗中，“管數(shù)”的增加表明血管生成增強，因為它提供了更多的管道來輸送氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。“連接點數(shù)量”反映了血管網(wǎng)絡的復雜性和穩(wěn)定性，而“管長度”的增加表明血管結(jié)構(gòu)延伸。這些變化共同意味著血管網(wǎng)絡形成更有效、更穩(wěn)定、更廣泛的作用。在 BMSC 比例為 4:1 和 8:1 時觀察到最佳的血管生成反應。重要的是，在這些最佳比例下，BMSCsEnergizer與非 BMSCsEnergizer和 ECsEnergizer相比表現(xiàn)出顯著增強的血管生成潛力，這是在 4 小時和 8 小時時間點的一致發(fā)現(xiàn)（圖 2B、C；圖 S1，支持信息）。

為了更真實地評估 BMSC mito對內(nèi)皮細胞和血管生成能力的影響，進行了球體發(fā)芽試驗。結(jié)果顯示，當 EC 與 BMSC mito以 4:1 和 8:1 的比例共培養(yǎng)時，細胞發(fā)芽距離顯著增加且分支更密集（圖 2D、E）。通過體外球體發(fā)芽試驗，遷移距離的增加表明細胞遠離球體的移動增強。這意味著細胞的遷移能力得到提高，這對于血管生成等過程至關重要。遷移距離越大意味著細胞越有效地伸入周圍環(huán)境，可能有助于新血管或組織結(jié)構(gòu)的形成。該參數(shù)對于評估測試條件在組織再生和修復背景下的促血管生成潛力至關重要。

在我們的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)當BMSC與EC的比例為4:1時，血管生成能力達到峰值。這種差異可能歸因于快速增殖，從而可能增強了較小BMSC群體的血管生成潛力。然而，增加BMSC的總量并沒有按比例增強血管生成，這間接表明觀察到的益處并非僅僅源于BMSC分裂加速。我們假設，較低的BMSC數(shù)量可能會限制Energizer增強帶來的有益作用，而較少的EC可能會降低血管生成潛力。

為了進一步研究，我們使用裸鼠體內(nèi)皮下組織培養(yǎng)模型評估了 BMSCs mito在刺激 ECs 血管生成方面的血管生成潛力。對皮下組織的目視檢查顯示，與手術后第 2 天和第4 天的對照組相比，實驗組中新生的分支血管明顯增多（圖 3A）。組織學分析（包括 H&E 染色和 CD31 免疫細胞化學染色）顯示，實驗組在第 2 天就開始出現(xiàn)血管形成，與對照組和空白組觀察到的限制性效果形成鮮明對比。到第 4 天，所有組均出現(xiàn)血管形成，實驗組表現(xiàn)得更好（圖 3B-E）。還證明了Energizer移植在傷口愈合、肌肉修復和缺血條件下刺激內(nèi)皮細胞血管生成方面的潛力。這些發(fā)現(xiàn)共同驗證了Energizer移植在促進骨髓間充質(zhì)干細胞增強內(nèi)皮管形成方面的強大作用。

2.3. BMSCs 促進細胞與細胞間的直接相互作用，增強血管生成

在我們研究Energizer移植如何增強促血管生成功能的潛在機制的過程中，我們探索了其在涉及 BMSCs mito和 ECs 的間接和直接共培養(yǎng)實驗中的影響。用綠色熒光標記的 BMSCs mito和用紅色熒光標記的 hUVECs 促進了體外管形成和球體發(fā)芽。共聚焦顯微鏡顯示這些細胞類型之間緊密均勻的接觸（圖 4A、B），從而表明移植的Energizer在促進更具凝聚力的分布和更大相互作用面積方面發(fā)揮著關鍵作用。生理上，MSCs 和 ECs 的接近被認為可以促進血管生成，[ 18 ] MSCs 和 ECs 在體內(nèi)參與復雜的相互作用。[ 5,19 ]因此，這些發(fā)現(xiàn)表明細胞通訊的基本模式是通過細胞與細胞之間的直接相互作用發(fā)生的。

相比之下，與對照組（僅含BMSC）相比 ，間接共培養(yǎng)的BMSCEnergizer在促進血管生成方面沒有顯著差異（圖4C-H）。這表明細胞通訊可能不涉及可溶性因子分泌以外的機制。因此，我們采用了直接共培養(yǎng)模型，該模型證明了由細胞間直接相互作用驅(qū)動的血管生成顯著增強。

2.4. Dll4‐Notch1信號對于BMSCsEnergizer促進內(nèi)皮管形成至關重要

Notch 信號通路在細胞間直接相互作用中起著基礎性作用，尤其是在骨骼系統(tǒng)內(nèi)，從而對骨血管生成和成骨作用產(chǎn)生深遠的影響。[ 19 ]因此，我們旨在通過探索 BMSCs mito與 Notch 信號通路的關聯(lián)來闡明其在促進內(nèi)皮管形成中的關鍵作用。為了深入研究潛在的下游機制及其與 Notch 信號通路的潛在聯(lián)系，我們對 BMSCs mito和 ECs 進行了 24 小時的直接共培養(yǎng)，然后通過流式細胞術分選以分離純的 BMSCs mito和 ECs 群。

與對照 BMSC 相比，將 BMSCs mito與 ECs 共培養(yǎng)，結(jié)果顯示 DLL4 mRNA 和蛋白質(zhì)表達水平顯著增加（圖 5 A,C）。此外，將 ECs 與 BMSCs mito共培養(yǎng)可增強 Notch1 受體及相應 Notch 信號通路中下游信號分子的激活（圖 5B,D）。

為了驗證 DLL4‐Notch1 信號通路的作用，我們抑制了 hBMSCs [BMSCs mito (D4‐)] 中的 DLL4（圖 5E、F）。同時，我們在 ECs [ECs (N1‐)] 中誘導 Notch1 敲除（圖 G、H），并使用 Notch1 抑制劑橘皮素。體外管形成試驗顯示，與 BMSCs mito ‐ECs 組相比，BMSCs mito (D4‐) ‐ECs組的血管生成功能降低（圖6 A-D）。此外，與 BMSCs mito共培養(yǎng)相比，將 EC 與 BMSCs mito (D4‐) 共培養(yǎng)會導致 Notch1 和下游信號基因的表達水平降低（圖 5I）。擴展這些觀察結(jié)果，在病毒載體或抑制劑誘導的內(nèi)皮細胞（EC）Notch受體或信號通路抑制后，也觀察到了類似的血管生成功能降低（圖 6E-L ）。這些數(shù)據(jù)強調(diào)了DLL4-Notch1信號通路在BMSCsEnergizer促血管生成作用中的關鍵作用。

2.5. BMSCs mito與 ECs 聯(lián)合移植后增強功能性血管網(wǎng)絡形成及對骨修復的治療效果

基于在體內(nèi)和體外實驗中觀察到的 BMSCs mito -ECs 促進血管生成方面的積極成果，我們的研究隨后深入評估了三個不同的組：空白組、對照組（BMSCs-ECs）和治療組（BMSCs mito- ECs）。本研究主要關注點在于使用大鼠顱骨缺損模型，仔細觀察功能性血管網(wǎng)絡的發(fā)育情況，并評估這些實驗組中骨修復的進展情況（圖 7 A）。

光學相干斷層掃描血管造影成像檢測到組織缺損內(nèi)的血流信號，勾勒出血管結(jié)構(gòu)的輪廓。術后 1 周和 2 周的 OCTA 結(jié)果顯示，實驗組的強血管形成密度明顯高于對照組和空白組（圖 7B  ）。此外，術后 2、4 和 8 周捕獲的微型 CT 圖像顯示，實驗組與對照組和空白組相比，新生骨的積累更多（圖 7C）。骨礦物質(zhì)密度 (BMD) 分析表明實驗組的 BMD 值明顯高于對照組（圖 7D、E）。組織學評估顯示實驗組缺損區(qū)域內(nèi)有新生骨形成（圖 7E）。

這些共同的研究結(jié)果凸顯了Energizer移植在促進骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）Energizer-內(nèi)皮細胞（mito -ECs）信號轉(zhuǎn)導方面的巨大潛力，這種信號轉(zhuǎn)導能夠增強血管生成和骨再生。Energizer移植此前已在包括骨再生在內(nèi)的多種治療領域得到探索。然而，我們的研究推進了這一領域，證明將健康Energizer移植到人骨髓間充質(zhì)干細胞（hBMSCs）中，并建立優(yōu)化的BMSCsEnergizer-內(nèi)皮細胞（ mito -ECs）共培養(yǎng)系統(tǒng)，可在體外和體內(nèi)模型中顯著增強其血管生成能力。

值得一提的是，天然 MSCs，尤其是那些位于組織內(nèi)的 MSCs，通常充當血管周細胞。正如 Crisan 等人[ 20 ]所證明的，這些細胞積極支持和維持血管微環(huán)境內(nèi)的血管完整性。這與 BMSCsEnergizer在共培養(yǎng)時作為周細胞與 EC 重新結(jié)合的能力相一致。Schadler-Stewart 等人[ 21 ]闡明了 DLL4-Notch 信號在血管生成過程中周細胞形成中的作用，這為我們的觀察提供了機制上的見解。我們的研究發(fā)現(xiàn)，DLL4-Notch1 信號通路對于在 BMSCsEnergizer-EC 共培養(yǎng)中觀察到的增強的血管生成活性至關重要。這表明Energizer移植可以通過增強 MSCs 的周細胞樣特性來增強其內(nèi)在的促血管生成功能。

在骨再生中，3D 基質(zhì)內(nèi)細胞的空間排列和相互作用對于有效的組織形成和血管化至關重要。[ 22 ]例如，BMSC-EC 在 3D 環(huán)境中共培養(yǎng)，尤其是在細胞外基質(zhì) (ECM) 成分的支持下，已證明血管生成結(jié)果有顯著改善。[ 23 ]研究表明，在 ECM 成分的支持下，BMSC 和 EC 的 3D 聚集體可以創(chuàng)造一個更符合生理學的環(huán)境，以支持強勁的血管生成。[ 24 ]由于 ECM 支持的 3D 聚集體可以有效改善血管生成，因此這也可能與Energizer移植產(chǎn)生協(xié)同作用。這些 3D 配置還可以促進細胞間基礎Energizer的轉(zhuǎn)移，增強其整體再生潛力。

這項研究表明，接受Energizer移植的骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）能夠促進內(nèi)皮細胞（ECs）的血管生成和骨再生，這可能為骨組織再生治療提供一種創(chuàng)新且可行的方法。然而，考慮到間充質(zhì)干細胞存在腫瘤形成的風險，將BMSCsEnergizer移植用于治療仍有很長的路要走。

細胞培養(yǎng)

兩種人類原代細胞培養(yǎng)物 hUVEC 和 hBSMC 均從 ScienCell Research Laboratories 購買，并在市售間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基 (MSCM; 7501; ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA USA) 和內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基 (ECM; 1001; ScienCell Research Laboratories) 中培養(yǎng)。兩種原代Sprague-Dawley大鼠細胞培養(yǎng)物，rBMSCs和RAECs，購自武漢普賽爾生命科技有限公司，培養(yǎng)于α-MEM（Hyclone SH30265.01）和高糖DMEM（Hyclone SH300222.01）培養(yǎng)基中，并添加10% (v/v) 胎牛血清（FBS）（Procell 164210-50）和1% (v/v) 青霉素-鏈霉素溶液（Procell PB180120）。細胞培養(yǎng)于37 °C、5% CO 2的濕化培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基每1至2天更換一次。實驗中使用的所有細胞均在第4至7代之間。實驗過程中所有步驟均避免細胞和Energizer暴露于EDTA。對于Energizer移植，將供體和受體 BMSCs 以每孔 2 × 10 5 個細胞的密度接種到 6 孔板中，36 小時后收獲供體 BMSCs。根據(jù)制造商的說明，使用培養(yǎng)細胞Energizer分離試劑盒（美國伊利諾伊州羅克福德市 ThermoFisher）從供體 BMSCs 中分離Energizer。進行一系列差速離心步驟以分離Energizer和胞漿級分。將分離的Energizer直接懸浮在 1 mL 完全培養(yǎng)基中，并在移植前置于冰上。去除受體 BMSCs 的上清液，并將Energizer懸浮液緩慢添加到接近孔底的位置。對于對照 BMSCs，也去除上清液，并加入 1 mL 不含Energizer的培養(yǎng)基。將整個培養(yǎng)板在4°C下以1500 rcf離心15分鐘，然后放入37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，并在相同條件下再次離心，以促進細胞Energizer的攝取。之后將細胞放回37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，以備后續(xù)實驗。

體外管形成試驗

在無菌條件下，將24孔板每孔以250 µL Matrigel（美國新澤西州富蘭克林湖市Becton, Dickinson and Company公司）包被，包被過程中不得出現(xiàn)氣泡。然后將板在37 °C下孵育至少30分鐘，以使Matrigel完全凝固。接下來，將 hUVECs ： hBMSCs 的比例為 16:1（11.3 × 10 4 hUVECs 和 0.7× 10 4 hBMSCs），hUVECs ： hBMSCs 的比例為 8:1（10.7 × 10 4 hUVECs 和 1.3 × 10 4 hBMSCs），hUVECs ： hBMSCs 的比例為 4:1（9.6 × 10 4 hUVECs 和 2.4 × 10 4 hBMSCs），hUVECs ： hBMSCs 的比例為 1:1（6 × 10 4 hUVECs 和 6 × 10 4 hBMSCs），以及 hUVECs（12 × 10 4 hUVECs）接種在 Matrigel 上。最后加入300 μL培養(yǎng)基，將24孔板放入37 ℃、5% CO 2培養(yǎng)箱中孵育，分別于4和8 h后在相差顯微鏡下觀察管狀結(jié)構(gòu)的形成情況。

內(nèi)皮細胞球體的生成

使用濃度為 (2% w/v) 的瓊脂糖形成細胞球模具，同時防止細胞粘附在模具表面。將瓊脂糖加熱形成熔融溶液，然后加入 3D 培養(yǎng)皿 (Microtissues)。凝固后，將瓊脂糖模具置于六孔板中培養(yǎng)細胞。然后，在每個模具上接種 180 µL 細胞懸液，其中 hUVEC : hBMSC 的比例為 4:1（12 × 10 5 hUVEC 和 3 × 10 5 hBMSC），hUVEC : hBMSC 的比例為 8:1（13.3 × 10 5 hUVEC 和 1.7 × 10 5 hBMSC），hUVEC的接種量為15 × 10 5 hUVEC。二十分鐘后，加入培養(yǎng)基，讓細胞聚集體形成 24 小時。

基于球體的發(fā)芽血管生成試驗

在體外發(fā)芽血管生成試驗中，將球體過夜培養(yǎng)，然后將其包埋于I型膠原蛋白（美國康寧公司）中，并加入培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)皿置于37°C下孵育，使膠原蛋白凝膠化。之后，讓球體分別發(fā)芽12和24小時。之后，使用Image Pro Plus軟件測量每個球體中長出的“噴”的長度，并對每個實驗組8個球體進行分析，從而對體外發(fā)芽進行數(shù)字定量分析。

慢病毒的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)染

所有用于敲低 Notch1 和 DLL4 的與綠色熒光蛋白 (GFP) 融合的慢病毒載體均從上?；騽P生物技術有限公司 (中國上海) 購買。

轉(zhuǎn)染scramble基因的細胞作為對照。慢病毒轉(zhuǎn)染前一天，將hBMSCs和hUVECs接種于6孔板中，密度為15 000個細胞/cm −2。接下來，將1 µL慢病毒顆粒（1.5 × 10 8 TU mL −1；上?；騽P化學有限公司，上海，中國）與5 µg mL −1聚凝胺（上?；騽P化學有限公司）和1 mL培養(yǎng)基加入細胞培養(yǎng)16小時。接下來，使用嘌呤霉素（P8833；Sigma-Aldrich）篩選轉(zhuǎn)染細胞3天。

蛋白質(zhì)印跡法

將培養(yǎng)的細胞用添加了蛋白酶抑制劑混合物（ThermoFisher，美國伊利諾伊州羅克福德）的 RIPA 裂解緩沖液（碧云天，中國上海）在冰上裂解。使用 BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒（ThermoFisher，美國伊利諾伊州羅克福德）對蛋白質(zhì)濃度進行定量分析。將六倍濃縮的 SDS 上樣緩沖液（P0015F；碧云天）加入蛋白質(zhì)中，然后在 100°C 下加熱 5 分鐘。然后，通過 10%（w/v）十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白質(zhì)提取物（30 µg），并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。用 5%（w/v）脫脂牛奶封閉膜，然后在 4°C 下與一抗孵育過夜，接著與偶聯(lián)辣根過氧化物酶（HRP）的二抗孵育。使用eECL Western Blot試劑盒（江蘇科威生物科技股份有限公司）在膠片曝光機上進行放射自顯影。一抗Notch1（A19090）和DLL4（A12943）購自Abclonal公司。抗β‐肌動蛋白（AF0003）的一抗和HRP標記的IgG二抗（A0208、A0216）購自碧云天公司。以β‐肌動蛋白作為蛋白上樣對照。蛋白表達水平以β‐肌動蛋白為標準進行標準化。

實時定量RT-PCR分析

使用 TRIzol 試劑（Invitrogen，美國）根據(jù)制造商說明提取總 RNA。然后使用不同的引物進行擴增。使用生物光度計（Thermo Scientific NanoDrop8000）對獲得的 RNA 的質(zhì)量和數(shù)量進行分光光度分析。然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara Bio Inc.，日本）將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補 DNA（cDNA）。使用 SYBR Green PCR 試劑盒（Roche，德國）在 ABI QuantStudio 3 實時 PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國加利福尼亞州福斯特城）上進行定量實時聚合酶鏈式反應 (qPCR)。所有值均以 GAPDH 為標準進行標準化。

動物實驗：動物和外科手術

本研究使用 60 只 7 周齡雄性 Sprague-Dawley (SD) 大鼠。實驗方案經(jīng)北京大學動物保護和使用委員會批準 (LA2017108 和 LA2019297)。為建立顱骨缺損模型，大鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射苯巴比妥鈉 (100 mg kg −1 ) 麻醉后，手術暴露背部顱骨。用鹽水冷卻的環(huán)鉆在頂骨每側(cè)造成兩個臨界大小的全層骨缺損 (直徑 5 mm)。分為 3 組 ( n =5)：空白組 — 雙側(cè)僅填充 Matrigel；對照組 — 雙側(cè)填充 Matrigel 和 4 × 10 5 rAEC 和 1 × 10 5對照 rBMSC；和治療——兩側(cè)均用 Matrigel 填充，每個缺損處填充 4 × 10 5 rAEC 和 1 × 10 5 rBMSCs mito 。

本研究使用18只8周齡雄性Balb/c裸鼠，裸鼠皮下注射細胞。實驗分為3組（n =6）：空白組：雙側(cè)注射Matrigel和10 × 10 6 hUVEC；對照組：雙側(cè)注射Matrigel和8 × 10 6 hUVEC及2 × 10 6 hBMSC；治療組：雙側(cè)注射Matrigel，同時每側(cè)注射8 × 10 6 hUVEC和2 × 10 6 hBMSC 。分別于2天和4天后收獲移植瘤。

動物實驗：微型CT掃描評估

移植后1、2、4和8周，取顱骨樣本，在4% (w/v) 多聚甲醛溶液中4 °C固定36小時。隨后使用Viva40微型CT掃描儀（Scanco Medical. AG）檢查標本。分析骨體積，并使用Scanco軟件基于處理后的圖像進行三維重建。

動物實驗：組織學分析

微型CT分析后，將大鼠顱骨脫鈣并石蠟包埋。對顱骨缺損中心部位5µm厚的組織切片進行組織形態(tài)學分析。然后，根據(jù)制造商的方案，對切片進行蘇木精-伊紅(H&E)和Masson三色染色。使用安裝在尼康Eclipse E800顯微鏡上的奧林巴斯D70相機拍攝圖像。

動物實驗：統(tǒng)計分析

結(jié)果以平均值±標準誤 (SEM) 表示。兩組以上數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析 (one-way unstacked ANOVA) 和事后 LSD 檢驗。兩組配對樣本間的比較采用雙尾非配對學生 t檢驗。p值小于 0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。