遺傳疾病會導致許多復雜且難以治愈的病癥。編碼每個人的復雜性和許多疾病風險的 DNA 序列包含在線粒體基因組、核基因組和微生物宏基因組中。這些疾病的診斷已統(tǒng)一在下一代 DNA 測序的應用上。然而，將特定的基因診斷轉化為有針對性的基因療法基因解碼基因檢測的一個中心目標。迄今為止，基因療法已分為三大類：用新的外源基因組大量替換受影響的基因區(qū)域、非靶向添加外源遺傳物質以補償基因突變所造成的功能缺失或異常，以及最近使用基因編輯直接糾正致病基因變異。診斷、治療和試劑輸送到每個基因區(qū)的通用方法將加速下一代治愈性基因療法的發(fā)展。遺傳病的基因矯正治療討論了線粒體、核和微生物宏基因組的結構和變異性，以及針對每個區(qū)的基因診斷和基因療法的歷史發(fā)展和當前實踐。

未來幾年將會怎樣徹底治療遺傳病關鍵詞

遺傳病、基因治療、基因編輯、基因診斷、臨床遺傳學

《人體基因序列變化與疾病表征》關于基因治療的介紹

遺傳病和治療的早期歷史

遺傳密碼的細微變化都可能導致極其嚴重的疾病和多種多樣的病癥。人類特征的遺傳性自古典時代就開始被描述。在現(xiàn)代醫(yī)學史上，第一種已知的遺傳性疾病是尿黑酸尿癥，于 20 世紀初被發(fā)現(xiàn)并記錄入冊，從而讓人們認識到先天性代謝缺陷。以人類遺傳密碼突變和改變?yōu)榛A的疾病是沉重的負擔，遺傳性疾病的發(fā)病率超過 5%，并是三分之二的流產的背后的原因。除了高度滲透的單基因疾病和大規(guī)模的染色體改變之外，許多常見疾病，如心血管疾病等都具有明確的遺傳基因原因。將遺傳疾病傳給下一代的可能性加劇了人們對這些疾病的恐懼。

20 世紀 40 年代末，在鐮狀細胞性貧血中發(fā)現(xiàn)了第一個與疾病相關的蛋白質遺傳變異，當時人們發(fā)現(xiàn)電泳過程中發(fā)生了改變，這種改變與受檢患者的疾病狀態(tài)相對應。隨后，在破譯了氨基酸的 DNA 密碼后，科學家認識到 DNA 變異有可能導致酶的變異，從而導致疾病。在 DNA 測序問世之前，唐氏綜合癥的病因是 1959 年發(fā)現(xiàn)的染色體異常 21 三體性，這是第一個被發(fā)現(xiàn)與疾病相關的人類基因變異。從 20 世紀 60 年代開始，可以通過生化方式篩查苯丙酮尿癥等遺傳代謝紊亂，而無需知道致病基因的位置或序列。 20 世紀 70 年代和 80 年代，桑格測序和重組分子生物學的出現(xiàn)首次使 DNA 序列測定變得廣泛可用。在隨后的幾十年里，直到 2003 年人類基因組計劃完成，基因圖譜聯(lián)盟付出了巨大的努力，才發(fā)現(xiàn)了一些最嚴重疾病的致病基因，包括 1983 年首次繪制的人類遺傳疾病亨廷頓氏病。隨著過去 20 年來外顯子組和全基因組測序成本的下降，基因診斷變得越來越可行，即使以前不被認為是遺傳疾病的疾病實際上也是基因序列的變化引起的?！度梭w基因序列的變人與疾病表征》的編制是這些發(fā)展進入臨床應用的有利工具。

人類基因信息的組成

成年人的遺傳物質可分為大小、遺傳性和多樣性各異的部分。線粒體基因組是最小的（僅 16.5 kb），但也是迄今為止最豐富的基因組，它是母系遺傳的，在人類群體中差異很小。細胞核中包含的傳統(tǒng)人類基因組要大得多，并且含有導致大多數(shù)傳統(tǒng)遺傳疾病的突變。細胞核和線粒體基因組在受孕時就已確定，盡管體細胞突變可能導致嵌合性疾病、癌癥甚至衰老。

更廣泛地說，適應性免疫受體庫是核基因組的一個獨特子集，微生物宏基因組僅在受孕后才確定，它們的遺傳復雜性（至少以獨特蛋白質編碼序列的多樣性來衡量）遠遠超過其余的核基因組。適應性免疫系統(tǒng)的 T 細胞和 B 細胞經(jīng)歷體細胞重組，產生的獨特蛋白質產物比核基因組的其他基因多幾個數(shù)量級，共同構成適應性免疫受體庫。最后，微生物組中的非人類細胞可能構成所有基因組中最具活力和多樣性的部分，其中有一系列不同的物種，主要是細菌和病毒，占據(jù)著人類皮膚、性器官、胃腸道和呼吸道的結構化生態(tài)位。適應性免疫受體庫和微生物宏基因組在個體之間的差異都很大，越來越多的研究旨在了解免疫受體庫和微生物組中的遺傳變異如何導致疾病病理。

基因治療模式

任何一個環(huán)節(jié)的破壞，在許多情況下與環(huán)境因素相互作用，都可能導致不同種類的遺傳疾病。DNA密碼的簡單性自 20 世紀 60 年代以來就吸引了研究人員和臨床醫(yī)生，他們希望通過糾正基因改變或基因治療來治愈疾病。自 20 世紀 70 年代初首次成功在人體細胞中異位表達外來基因以來，基因治療技術不斷發(fā)展，提高了基因轉移的效率、特異性和安全性。這些進展促使美國國立衛(wèi)生研究院的國家癌癥研究所于 20 世紀 80 年代末首次在人體上進行基因治療試驗，此前曾有過幾項測有受到監(jiān)管且最終未發(fā)表的基因治療嘗試。

20 世紀 90 年代，基因療法迅速發(fā)展，共啟動了 500 多項試驗。然而，21 世紀初，由于嚴重聯(lián)合免疫缺陷 (SCID) 和代謝性肝病的基因治療臨床試驗中患者死亡，基因療法陷入停滯。21 世紀的第一個 10 年，基因轉移的安全性和有效性進一步提高，最終導致新一代基因治療方法的復蘇。2017 年，美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 批準了首個基于離體嵌合抗原受體 T 細胞 (CAR-T) 的 B 細胞惡性腫瘤基因療法，以及 2017 年首個針對萊伯氏先天性黑蒙所致視力喪失的體內基因療法。

廣義上講，基因突變可以通過三種一般方式改變：對包含突變的整個基因組區(qū)域進行批量替換或選擇、在基因組中非靶向插入額外的遺傳物質以恢復足夠的功能來補償基因缺陷（非靶向添加），或僅對致病突變或基因改變進行特異性校正（基因編輯）。批量替換是最基本的基因治療形式（圖1）。選擇性生殖以及最近的植入前診斷提供了預防性避免核基因組中種系突變的機會。線粒體替代療法和體外受精可以通過用“第三個父母”替換孩子的整個線粒體基因組來有效糾正線粒體突變。同樣，導致腫瘤的體細胞突變可以通過手術從體內批量切除。通過糞便或微生物群落移植，微生物宏基因組的部分內容越來越多地被治療性地改變。

然而，對于許多患者來說，一種更可行的基因療法是非靶向性地引入新的遺傳物質，以彌補突變序列丟失或有害的功能（圖2）。這種非靶向性遺傳物質的添加在模型生物的生殖系轉基因中很常見，但重要的倫理問題適當?shù)刈柚沽巳祟惿诚档奶砑有曰虔煼āＴ诟咧委熞饬x的體細胞中，從SV40到逆轉錄病毒、腺病毒以及現(xiàn)在最突出的腺相關病毒（AAV）假型，連續(xù)幾代病毒載體已經(jīng)能夠對接受新的、校正遺傳物質的體內細胞類型進行更大的控制，最終導致FDA最近批準了一種針對視桿細胞和視錐細胞的特異性AAV2載體?；?γ 逆轉錄病毒和慢病毒的獨立技術開發(fā)路線已實現(xiàn)對造血干細胞 (HSC) 核基因組以及 T 細胞適應性庫的有效體外操作，從而產生了同樣最近獲批的基于 CAR-T 的療法。

然而，血紅蛋白?。ǖ谝环N通過分子學特征鑒定的遺傳?。┑幕蛑委煔v史揭示了非靶向基因添加的局限性。在早期試驗中，鐮狀細胞性貧血和其他血紅蛋白病患者在將正確的偽血紅蛋白拷貝隨機添加到其 HSC 基因組中時，紅細胞生成過程中對 α 和 β 血紅蛋白的嚴格調控阻止了紅細胞的形成。近年來，靶向 RNA 引導核酸酶（如 CRISPR/Cas9（成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列/胱天蛋白酶-9））的快速發(fā)展，這些核酸酶以早期的鋅指核酸酶 (ZFN) 和轉錄激活因子樣效應核酸酶 (TALEN) 靶向核酸酶為基礎，為治療此類遺傳病提供了一種簡化的方法。通過在突變位點附近產生雙鏈 DNA 斷裂，這些核酸酶可以促使細胞通過模板修復來修復損傷，該修復基于單獨提供的包含所需序列的 DNA 模板。各種遞送技術可以將編碼核糖核蛋白 (RNA/蛋白質) 核酸酶復合物 (RNP) 的 DNA 或重組 RNP 本身以及 DNA 模板運送到體外和體內越來越多的靶細胞群中，以糾正特定突變。這些基因編輯技術有望具有糾正基因組中幾乎所有突變的通用能力（圖 2）。

遺傳病困擾了一代又一代的家庭和醫(yī)生。每個人類基因組區(qū)段的獨特性質都帶來了不同的診斷和治療挑戰(zhàn)。DNA 測序、將蛋白質和 DNA 有效載荷體外和體內遞送到特定人類細胞群、插入大量新遺傳物質以及現(xiàn)在直接編輯內源性基因位點的技術已經(jīng)取得了重大進展。越來越多的診斷和治療方案可以針對所有人類基因組區(qū)段，而它們的進一步發(fā)展為普遍治愈性基因療法帶來了希望（圖 3）。

線粒體基因組

線粒體基因組是人體中最小也是最豐富的遺傳信息集。保守估計，成年人體內存在超過 1 千萬億個線粒體拷貝，不同的人體組織每個細胞具有零到數(shù)千個線粒體，每個線粒體平均有 1 到 2 個 16.5 kb 的線粒體基因組拷貝。人體內的所有線粒體都是由重復的分裂循環(huán)產生的，這些分裂源自卵子發(fā)生過程中瓶頸最大的原始卵細胞中不到 10 個線粒體，最終是無性繁殖不間斷循環(huán)的后代，可追溯到第一個真核線粒體共生體。這種之前自由生活的祖先共生細菌可能擁有數(shù)千個基因。然而，在數(shù)億年的時間里，線粒體基因通過內共生基因轉移相繼遷移到相對安全的核基因組中。剩下的 37 個線粒體基因編碼 22 個轉移 RNA、2 個線粒體核糖體 RNA 和 13 個蛋白質編碼基因，這些基因主要編碼電子傳遞鏈中量子連接的成員。這些基因占基因組的 90% 以上，其余部分由線粒體控制區(qū)的非編碼元件組成。

線粒體基因組對細胞能量轉換至關重要，因此在人類中高度保守，盡管在真核生物中，線粒體基因組的大小和基因含量差異很大。純化選擇推動了線粒體基因組序列的保守性，因為線粒體 DNA 復制的錯誤率比核復制的錯誤率大約高 100 倍。考慮到線粒體基因組的緊湊性，插入/缺失 (indel) 和重排等較大范圍的基因改變幾乎總是無法實現(xiàn)的。在卵子發(fā)生過程中，線粒體會經(jīng)歷強烈的純化選擇，大約五分之一的兒童具有新生線粒體突變，主要是同義突變。在體細胞中，線粒體之間連續(xù)的裂變和融合循環(huán)可能使未突變的線粒體基因組拷貝能夠進行持續(xù)的純化選擇。線粒體在一生中大量分裂最終導致遺傳變化，成人線粒體中的體細胞嵌合體很容易被檢測到。老年人的線粒體相對于成人遺傳基因組具有數(shù)百種遺傳變化。

線粒體遺傳病

線粒體功能至關重要且普遍存在，因此線粒體基因組內的突變會對健康產生巨大且有害的影響。雖然大多數(shù)線粒體突變可能會導致卵母細胞無法存活，并在排卵前被淘汰，但每 5,000 個活產嬰兒中約有 1 個被診斷出患有肌病和神經(jīng)病等線粒體疾病。線粒體基因組中每個蛋白質編碼基因的種系突變都與臨床疾病有關。更有推測稱，體細胞線粒體突變的積累與各種衰老疾病有關。

線粒體基因組是第一個被完全測序的人類遺傳區(qū)段，1981 年，桑格測序宣布確定了整個基因組。如今，全線粒體基因組測序可以通過下一代測序快速完成，盡管線粒體測序并不是新生兒篩查計劃的常見組成部分。最近，成人線粒體表現(xiàn)出的遺傳嵌合性甚至使人類克隆細胞群的譜系追蹤成為可能，這可能有助于診斷與年齡有關的疾病。

線粒體基因治療

線粒體具有獨特的遺傳性，受精后表型迅速出現(xiàn)，每個細胞中線粒體數(shù)量眾多，以及線粒體周圍的物理和化學障礙，使得針對線粒體基因組的基因治療特別具有挑戰(zhàn)性。同樣，線粒體基因的緊湊性使得基于非靶向插入新遺傳物質（例如使用病毒載體）到線粒體基因組的策略不切實際。線粒體基因功能的中心地位意味著任何基因治療可能都必須糾正體內的大多數(shù)細胞，有利于生殖系糾正。

人類線粒體基因組體積小且序列高度保守，因此可以用供體的野生型線粒體大量替換含有已知遺傳疾病的卵母細胞線粒體，從而產生俗稱的三親嬰兒（圖 1a）。這種大量線粒體基因組替換實際上是反向進行的：從供體的卵母細胞中取出核基因組，用來自預期母親的卵母細胞之一的細胞核替換，然后進行體外受精。這種生殖系基因療法于 2016 年在英國獲批，用于治療遺傳性線粒體疾病，并可在由此產生的孩子中實現(xiàn)可遺傳的生殖系矯正。

然而，對于出生時就帶有新生線粒體突變的患者，種系大量線粒體置換只是他們自己孩子的一種選擇。在體細胞中糾正線粒體突變，特別是在足夠多的細胞和組織中糾正以達到臨床效果，是一項重大挑戰(zhàn)（圖 2a）。在某些情況下，可以通過使用非靶向病毒載體將線粒體基因整合到核基因組中，這一過程反映了線粒體基因的進化核運動。例如，在萊伯遺傳性視神經(jīng)病變 (LHON) 中，這是一種由 NADH 泛醌氧化還原酶亞基（包括 ND4）突變引起的線粒體疾病，導致青年期出現(xiàn)急性視力喪失，將校正的ND4基因拷貝插入核中可使一些人類患者的視力改善。通過使用經(jīng)過改造的 AAV 衣殼（該衣殼經(jīng)過改造后含有內源性線粒體靶向序列），已證明可以將遺傳物質非靶向地直接添加到線粒體中（盡管不是直接添加到線粒體基因組中）。將含有ND4（導致 LHON 急性視力喪失的致病基因）校正拷貝的線粒體靶向序列改造的 AAV 病毒注射到患病小鼠的眼睛中，同樣可以導致視力改善。

靶向核酸酶（如 CRISPR/Cas9）可實現(xiàn)線粒體基因組的直接基因編輯，盡管尚不清楚微同源介導或同源定向修復 (HDR) 是否在線粒體中常見。更直接的是，當突變僅影響細胞中的一部分線粒體時，受影響的線粒體基因組的靶向切割和線性化可導致突變線粒體相對于健康線粒體的相對丟失，正如使用 TALEN 在體外所證明的那樣。然而，總體而言，線粒體基因療法面臨著巨大的挑戰(zhàn)，即如何有效地將基因編輯試劑體內遞送到足夠多的體細胞中的線粒體基質中以實現(xiàn)臨床益處。

線粒體基因組包含真核生命起源之初基本共生事件的活體遺跡，除成熟紅細胞外，在人體所有細胞中均有多個副本。其剩余基因在細胞能量轉移中起著核心作用，其中的罕見突變僅影響約 0.02% 的活產，會導致衰弱性疾病。涉及大量替換受影響卵母細胞線粒體的生殖系基因療法可能是治療線粒體遺傳疾病的有效方法，盡管僅限于后代。針對線粒體基因組的體細胞基因療法尚處于早期開發(fā)階段，但它們面臨著巨大的物理和生物學障礙。相比之下，核基因的生殖系編輯在生物學和倫理上要復雜得多，而核基因組的體細胞基因療法則迅速普及。

核基因組

經(jīng)典的人類基因組或核基因組與較小的線粒體基因組具有更大的規(guī)模和復雜性，對診斷和基因治療提出了獨特的挑戰(zhàn)。人類核基因組含有大約 30 億個堿基對，分為 22 條常染色體和 XX 或 XY 性染色體各兩個拷貝，每組從父母雙方遺傳一組。只有約 2% 的基因組直接編碼大約 20,000 個蛋白質編碼基因中的 1 個，盡管非編碼元件、著絲粒和端粒等結構元件、啟動子和增強子等調控元件以及微小 RNA 和長鏈非編碼 RNA 等功能性 RNA 元件構成了非蛋白質編碼基因組空間的很大一部分。此外，三聯(lián)體重復、短散在核元件 (SINE) 和長散在核元件 (LINE) 等重復和自私遺傳元件占人類基因組內容的一半以上。成人體內約有 30 萬億個細胞，每個細胞都擁有一個二倍體核基因組拷貝，無核紅細胞、某些多核肌細胞和破骨細胞以及單倍體配子除外。平均而言，兩個不相關的人類基因組相差約 0.1%，其中五分之四的差異是由于個體差異造成的，其余五分之一的差異是由于人類群體之間的差異造成的。

種系遺傳疾病

人類基因組以每年 5 到 10 個基因變化的速度進化。人類 DNA 聚合酶與校對酶相結合，總錯誤率約為每復制 100 億個 bp出現(xiàn)1 個 錯誤的bp，在卵母細胞受精前約 22 輪分裂以及精子細胞數(shù)百輪分裂（隨父親年齡而變化）過程中會累積錯誤。小突變和插入/缺失并不是生殖系遺傳變化的唯一類別，DNA 復制和細胞分裂中的錯誤可導致重復擴增、大量缺失、染色體易位以及常染色體和性染色體非整倍體。然而，在配子形成和受精后，存在著廣泛的選擇壓力，估計有 10-40% 的受精胚胎無法植入，總體而言，40-60% 的受精妊娠無法活產。例如，在 22 條常染色體中，只有 21 號染色體的非整倍性（導致唐氏綜合征）與長壽相容，而任何其他常染色體的非整倍性在胚胎形成期間或出生后不久都是致命的?？傮w而言，每個人類新生兒在新受精胚胎中平均含有 10-20 個來自母體的新生突變和 25-75 個來自父體的新生突變，這些突變有可能發(fā)生在功能性蛋白質編碼或非編碼序列中。除了新生突變之外，每個新生兒還遺傳有大約 100 個基因的種系功能喪失單等位基因突變，甚至估計有 20 個基因的雙等位基因功能喪失突變。

出生后出現(xiàn)的遺傳病通常會影響神經(jīng)、免疫和代謝系統(tǒng)，而這些系統(tǒng)在子宮內的支持性環(huán)境中基本上不受選擇壓力。在 20,000 個蛋白質編碼基因中，超過 4,000 個基因的突變已被確定為導致特定人類遺傳病的病因。大約 3,000 個蛋白質編碼基因是人類細胞系所必需的，這些基因的功能喪失突變可能與配子發(fā)生或早期胚胎發(fā)育不相容。對人類種群規(guī)模和遺傳多樣性的估計預測，全球人類種群中已經(jīng)存在與生命相容的蛋白質編碼核基因組中所有可能的單堿基對變化 。對單蛋白遺傳病的基因型-表型關系的完整分類是一個可能的長期目標。

然而，核基因組的復雜性遠超其蛋白質產物，越來越多的非編碼調控和功能性 RNA 元件突變也被確定為導致遺傳疾病的原因。此外，2000 年代末和 2010 年代進行的全基因組關聯(lián)研究 (GWAS) 已將許多遺傳基因變異與常見疾病聯(lián)系起來，盡管 GWAS 的一個標志性發(fā)現(xiàn)是每種常見遺傳基因變異對常見疾病風險的貢獻相對較小。

在 21 世紀第二代測序技術和人類參考基因組問世之前，人們通過對限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP) 和其他可追蹤的遺傳變異區(qū)域進行仔細的基因圖譜繪制，發(fā)現(xiàn)了亨廷頓氏病和肌營養(yǎng)不良癥等疾病的致病遺傳變異 ，甚至基于 RFLP 實現(xiàn)了鐮狀細胞性貧血和地中海貧血等疾病的診斷檢測。如今，臨床上通過多種檢測方法進行種系遺傳診斷。導致生化缺陷的常見遺傳疾病通常無需測序即可通過化學方法診斷，例如新生兒苯丙酮尿癥和半乳糖血癥。傳統(tǒng)核型可以診斷大規(guī)模染色體異常，單核苷酸多態(tài)性微陣列可以檢測小規(guī)模（但仍有數(shù)千個堿基）的缺失。靶向測序面板（通過外顯子組測序與確認性桑格測序或直接通過桑格測序進行）是具有一致臨床表型的遺傳疾病的主要診斷方法。

對于沒有明確描述過遺傳綜合征的患者，對患病個體和父母雙方進行診斷性全外顯子組測序以及日益流行的全基因組測序，可以揭示多達 40% 患者的致病基因改變。大規(guī)模染色體異?？梢栽诔錾皬奶ケP組織或羊水中診斷出來，這些樣本也可用于 DNA 測序。對于臨床或遺傳上懷疑患有遺傳病的個體，母親血液中的循環(huán)胎兒 DNA 提供了一種侵入性較小的遺傳診斷方式。輔助生殖技術的進步甚至可以通過在體外受精后細胞分裂的最早階段去除極少量的細胞來實現(xiàn)基因測序和診斷。這些植入前診斷，加上更傳統(tǒng)的父母攜帶者檢測，可以準確診斷出特定核遺傳疾病的存在或風險。

在許多情況下，即使在生命的早期階段，生殖細胞的遺傳病也是可以診斷的。治療性糾正這些信息內容中的錯誤可以在生殖細胞內進行，也可以在生命后期在受影響的體細胞組織中進行。在每種情況下，基因治療策略可以分為三類：大量替換整個受影響的核基因組，即使三十億個堿基對中只有一個堿基對可能致?。环前邢蛱砑油庠催z傳物質以補償遺傳錯誤；以及通過基因編輯直接糾正致病突變。

種系基因治療

從廣義上講，患有生殖系遺傳病的患者或未來患者受影響的核基因組可通過生殖決策預先解決。在已知某種遺傳病攜帶者率高的社區(qū)，如攜帶 HEXA 基因突變（泰-薩克斯病的病因）的阿什肯納茲猶太人社區(qū)，有效的社區(qū)篩查和生殖咨詢已將篩查人群中患泰-薩克斯病的兒童比例降至基本為零。同樣，基于基因診斷的生殖決策使個別夫婦能夠通過使用精子或卵子捐獻者的體外受精，以及通過傳統(tǒng)的收養(yǎng)來防止遺傳疾病的傳播。從某種意義上說，所有這些都是解決生殖系遺傳突變的批量核基因組策略（圖 1b）。

直接向人類生殖系中添加新的遺傳物質，或對內源性生殖系序列進行基因編輯，在倫理上是一個重大的舉措，截至 2020 年，科學、醫(yī)學、倫理、宗教和政府界普遍認為這是不恰當?shù)模▓D 2b）。2018 年，首次公開宣布人類生殖系基因編輯嘗試，引起了科學界的強烈憤慨 ，凸顯了政府和科學界進行嚴格監(jiān)督和監(jiān)管的必要性。

體細胞遺傳疾病

受精時存在的突變會被身體的每個細胞遺傳，但基因復制錯誤會在每個體細胞分裂周期中繼續(xù)發(fā)生，并由于紫外線、輻射和誘變劑暴露等環(huán)境因素而不斷積累。成熟體細胞類型的細胞分裂次數(shù)與該細胞類型發(fā)展成腫瘤的傾向之間存在線性相關性，這突顯了不同組織最終體細胞中遺傳錯誤積累的不同。腸上皮細胞等細胞類型的干細胞可以經(jīng)歷數(shù)百輪分裂，與分裂次數(shù)低的成骨細胞或神經(jīng)元相比，它們更容易引發(fā)腫瘤。由于一個細胞中的突變會遺傳給未來從該細胞衍生的所有體細胞，因此胚胎發(fā)生早期的變化可能導致大片組織甚至整個器官出現(xiàn)有時有害的突變。最終，由于這種體細胞嵌合性，成年人體內的兩個不同體細胞可能會有數(shù)千個堿基對的差異。

早期發(fā)育過程中的體細胞突變可導致許多與生殖系突變相同的遺傳疾病，其嚴重程度取決于嵌合程度和受影響的終末器官。例如，在由OTC基因的 X 連鎖隱性突變引起的鳥氨酸轉氨甲酰酶缺乏癥中，患有生殖系突變的患者如果不進行肝移植，很少能在童年時期存活下來，但患有體細胞突變的患者，即使是那些影響大量受影響細胞類型（肝細胞）的患者，通過改變飲食可以過上相對正常的生活。體細胞突變經(jīng)歷許多與生殖系相同的選擇壓力，有強有力的證據(jù)表明錯義突變會被選擇。然而，增加細胞分裂率的體細胞突變，尤其是在分化較低的干細胞群體中，可以沿著明確的突變路徑進行，直至致癌轉化。就結腸癌而言，APC早期驅動突變的獲得，隨后是增殖增加、KRAS 突變，最后是 p53 突變，這反過來又進一步降低 DNA 復制保真度，引發(fā)一系列 DNA 變化，最終導致癌癥。更廣泛地說，正常組織中體細胞突變在生命過程中的積累，除了增加癌癥風險外，還可能導致與年齡相關的功能下降。

DNA 測序通量的進步，特別是高覆蓋率的全外顯子組和基因組的進步，同樣增強了診斷體細胞致癌和其他有害遺傳變化的能力。自 20 世紀 80 年代發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因（如p53）和致癌基因（如KRAS）的體細胞突變以來，越來越多的致癌突變被收錄入《人體基因序列變化與疾病表征》數(shù)據(jù)庫。隨著 2018 年癌癥基因組圖譜測序項目的結束，估計有 300 個癌癥驅動基因中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個突變 ，只剩下極少數(shù)突變需要通過更大規(guī)模的癌癥隊列測序來識別 。腫瘤、癌前病變和健康組織的臨床體細胞基因組測序正變得越來越常規(guī)，單突變面板正被多基因、外顯子組或全基因組測序所取代 。隨著進一步的發(fā)展，利用無細胞DNA測序等侵入性較小的方法檢測早期腫瘤的DNA序列和表觀遺傳改變，甚至可以將體細胞基因組測序擴展到大規(guī)模人群篩查應用。

體細胞遺傳療法

針對體細胞基因組的基因療法可以通過特定的內源性基因編輯和糾正恢復正常序列來糾正遺傳缺陷，非靶向地向基因組添加外源性遺傳物質以補償突變，或大量替換體細胞基因組。體細胞基因組中的基因療法進一步區(qū)分為僅需要替換、添加或糾正目標組織（例如肝臟、肌肉或眼睛的組織）中的遺傳信息。此外，對于可以在體外培養(yǎng)的某些細胞類型（例如 HSC 和 T 細胞），這些基因療法可以在體外進行，并將改變的細胞返回到患者體內。但是，對于大多數(shù)目標組織，體細胞基因療法必須克服在體內遞送遺傳物質和編輯試劑的挑戰(zhàn)，同時避免被患者自身的免疫系統(tǒng)排斥。

與生殖系療法中操作單個細胞相比，由于需要進行基因改變的細胞數(shù)量巨大，因此批量替換體細胞基因組中的基因改變同樣困難。對于某些疾病，例如由PKD1、PKD2、PKD3和PKHD1基因突變引起的多囊腎病，通過移植更換患病的腎臟可有效去除致病遺傳物質，但肝臟等其他器官仍然受到影響。同樣，當腫瘤可手術時，從某種意義上說，手術可以批量去除突變的體細胞基因組。通過避免已知的環(huán)境誘變源可減少體細胞突變負荷。

體細胞基因組的非靶向添加

最早以此命名的基因療法是基于對體外培養(yǎng)的免疫細胞（特別是 T 細胞和 HSC）的核基因組進行非靶向添加（圖 2b ）。20 世紀 80年代初，人們成功改造了第一種來自莫洛尼鼠白血病病毒 (MMLV) 的復制缺陷型逆轉錄病毒，這預示了后來來自人類免疫缺陷病毒的慢病毒載體的出現(xiàn)，大片段的數(shù)千堿基的新 DNA 可以被偽隨機地引入這些細胞類型中。首次基因轉移試驗使用 MMLV 衍生的逆轉錄病毒將異源腫瘤壞死因子 (TNF)-α 表達盒添加到從轉移性黑色素瘤患者腫瘤中分離并在體外擴增的 T 細胞中。

雖然與早期未經(jīng)修改的腫瘤浸潤淋巴細胞試驗相比，這項首次試驗并未帶來臨床益處，但它引發(fā)了隨后 30 年間大量 T 細胞和 HSC 的體外添加基因療法。在首次 T 細胞試驗后，在嚴重聯(lián)合免疫缺陷癥 (SCID) 兒童體外培養(yǎng)的 HSC 中非靶向添加腺苷脫氨酶的正確拷貝，在某些情況下，這些早期基因治療患者獲得了持久且迄今為止終身的治愈。這些體外添加逆轉錄病毒技術已擴展到當前基于 CAR-T 的療法中合成 DNA 序列的非靶向整合。

在體外基因添加療法發(fā)展的同時，病毒載體具有靶向特定人體組織類型和遞送外源 DNA 的雙重功能，已實現(xiàn)向多種體細胞類型進行體內基因添加（圖 2b）。肝臟肝細胞一直是活躍的靶組織，作為蛋白質生成工廠，用于添加缺失或功能失調的血液因子。在由循環(huán)凝血因子 VIII 和 IX 缺乏引起的血友病 A 和 B 病例中，向肝細胞體內添加新的因子 VIII 和 IX 基因已實現(xiàn)治愈性基因療法 。從腺病毒到現(xiàn)代工程化的 AAV 血清型和假型，多代病毒遞送系統(tǒng)已大大提高了體內體細胞基因療法的功效、特異性和免疫安全性。由于視網(wǎng)膜具有獨特的易接近位置和免疫特權組織狀態(tài)，因此也經(jīng)歷了大量的基因治療試驗。首個獲得 FDA 批準的體內基因療法確實將RPE65基因的異源拷貝添加到萊伯氏先天性黑蒙患者的視網(wǎng)膜細胞中，從而帶來持久的視力改善。

然而，非靶向添加基因療法受到各種限制。從功能上講，目前常用的 AAV 載體的基因攜帶能力僅限于約 4.5 kb，太小，無法編碼表達大型內源性蛋白質正確拷貝，例如在極端情況下，編碼肌營養(yǎng)不良蛋白所需的 10 kb 以上的互補 DNA，肌營養(yǎng)不良蛋白在肌營養(yǎng)不良癥患者中發(fā)生突變。同樣，早期試驗試圖將正確版本的 α 或 β 血紅蛋白插入鐮狀細胞性貧血和地中海貧血患者的 HSC，由于紅細胞發(fā)育過程中對血紅蛋白表達的調控不當，導致紅細胞生成失敗。

更重要的是，本世紀初基因治療臨床試驗中患者的死亡凸顯了偽隨機整合病毒載體的眾多安全問題。首先，1999 年，一名患有鳥氨酸轉氨甲酰酶缺乏癥的患者死亡，該患者因體細胞嵌合而患有輕度疾病，死因是病毒載體在體內將基因貨物遞送到患者肝細胞時產生了強烈的免疫反應。此外，對新近糾正的、因此被識別為非自身的內源性基因產物的免疫反應可能會限制杜興氏肌營養(yǎng)不良癥等疾病的治療效果。早期 X 連鎖嚴重聯(lián)合免疫缺陷癥 (SCID) 臨床試驗中，在離體編輯 HSC 時出現(xiàn)了一系列白血病，揭示了引入非靶向遺傳元件（包括驅動異源治療基因的強病毒啟動子）會帶來意想不到的后果 。病毒載體拷貝整合到致癌基因（如LMO2）附近，在最初成功治療多年后，會誘發(fā)致癌轉化。最后，一名類風濕性關節(jié)炎患者在成功接受抗 TNF 誘餌受體基因治療后，因組織胞漿菌病真菌感染而死亡，這一事件凸顯了偽隨機添加基因產物調控不當?shù)臐撛谖ｋU ；基因治療的靶向毒性可能會抑制患者發(fā)起有效免疫反應的能力。

體細胞基因組中的基因編輯

基于糾正目標體細胞類型中的個體致病突變的基因療法可以通過非靶向基因添加克服許多此類挑戰(zhàn)。所有經(jīng)歷細胞分裂的細胞都會嘗試通過多種 DNA 修復途徑修復 DNA 復制錯誤，包括 HDR，其中一條染色體上的突變可以通過結合另一條染色體上的同源區(qū)域并進行模板修復來糾正。20 世紀 80 年代，HDR 能夠在人類細胞系中的特定、用戶定義的位點無瘢痕地整合外源 DNA 序列，盡管最初的效率極低。雖然這對于轉基因模型生物的產生至關重要，但人類細胞的體內或體外治療應用仍有待開發(fā)出可靶向的 DNA 核酸酶，這種核酸酶可以在鄰近基因校正的預定位點產生雙鏈 DNA 斷裂。

這些靶向雙鏈斷裂將人類細胞中 HDR 的效率提高了許多個數(shù)量級，并在 21 世紀初促成了首次使用 ZFN 進行靶向基因編輯試驗，以糾正IL2RG中導致 SCID 的突變。21 世紀 10 年代中期，RNA 引導核酸酶（最突出的是 CRISPR/Cas9）的發(fā)現(xiàn)和快速發(fā)展，使這些基因編輯試劑的開發(fā)變得更加簡單和便宜。與含有同源臂的校正外源 DNA 模板配對，可以快速設計和合成用于在人類核基因組的幾乎任何位點進行內源基因編輯的試劑。甚至可以將 DNA 和蛋白質成分組合成單組分系統(tǒng)，使用 Cas9-逆轉錄酶融合蛋白以及帶有延伸 RNA 序列的引導 RNA，該延伸 RNA 序列包含預期的突變校正而不是同源 DNA 。該過程允許模板修復直接跟隨核酸酶識別，而無需額外的 DNA 序列，從而可能簡化試劑輸送。

事實上，將基因編輯試劑遞送到靶細胞中的挑戰(zhàn)是更廣泛地應用體細胞矯正基因療法的一大障礙。對于可以在體外培養(yǎng)的 HSC 和 T 細胞群，電穿孔等物理遞送方法能夠將核糖核蛋白（例如 Cas9-引導 RNA 復合物）和 DNA HDR 模板穩(wěn)健地遞送到靶細胞中 。在 HSC 中，針對 β-血紅蛋白中鐮狀細胞突變的 Cas9 RNPs 的電穿孔，再加上使用 AAV6 載體遞送含有正確序列的 HDR 模板，最終實現(xiàn)了對鐮狀細胞性貧血（第一種分子描述的遺傳?。┑闹虏⊥蛔兊姆€(wěn)健校正。這些校正后的 HSC 能夠完全分化，并且至關重要的是，進行紅細胞生成。輕松生成新的編輯試劑以針對其他突變可能使該策略廣泛應用于造血遺傳疾病。除了HSC之外，遺傳病的基因矯正治療還展示了如何使用類似的RNP電穿孔策略（而不是使用非病毒DNA）來直接糾正分化T細胞群（如調節(jié)性T細胞）中的致病突變。

通過基因編輯修復內源性遺傳序列也為體內體細胞基因治療提供了新途徑。值得注意的是，在肌營養(yǎng)不良癥等疾病中，蛋白質產物對于常用的病毒載體來說太大，基因編輯試劑已被設計并成功遞送至小鼠模型，以及許多其他快速發(fā)展的臨床前體內療法。體內基因編輯進一步凸顯了編輯試劑遞送的挑戰(zhàn)，因為必須將大型蛋白質核酸酶或編碼它們的 DNA 序列和矯正 DNA HDR 模板遞送至目標體細胞組織。在少數(shù)情況下，可能出現(xiàn)僅通過基因切割而非模板修復即可實現(xiàn)治愈性治療的創(chuàng)造性解決方案。更小的可靶向核酸酶、單組分模板修復系統(tǒng)以及最重要的遞送技術的普遍改進的開發(fā)，為加速體細胞組織的體內矯正基因治療帶來了巨大希望。

操控其他基因組

適應性免疫受體庫

體細胞亞群除了核基因組外，還包含一個獨特的細胞，即適應性免疫系統(tǒng)的 T 細胞和 B 細胞，它們在受孕后通過體細胞重組產生新的抗原受體基因產物。年輕成人的免疫受體庫保守估計包含大約 10 11 個獨特的抗原受體，產生的單個蛋白質產物比核基因組多出近 6 個數(shù)量級，不過庫的多樣性會隨著年齡的增長而下降 。T 細胞庫中 T 細胞受體 (TCR) 基因的存在或缺失可導致 1 型糖尿病和多發(fā)性硬化癥等疾病的發(fā)展，而自身反應性 B 細胞受體 (BCR)則是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力和許多其他疾病的基礎。在相反的情況下，由于防范自身免疫或癌癥微環(huán)境中所謂的免疫編輯的調節(jié)機制，適應性免疫受體庫有時缺乏潛在有用的 TCR 和 BCR，例如對液體和實體腫瘤有反應的 TCR 和 BCR 。

可以通過大量替換整個庫或選擇性引入所需的 TCR 和 BCR 序列來對核基因組的適應性免疫受體庫子集進行遺傳操作。這些細胞中的大多數(shù)對放射敏感，因此可以通過自體或同種異體骨髓移植大量替換該基因組區(qū)室，這種方法已成功用于治療嚴重的自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性硬化癥 。特異性引入所需抗原受體可以靶向難以接種疫苗的抗原，如內源性肽或掩蔽致病表位。自 2000 年代以來，病毒載體已在臨床上用于在原代人類 T 細胞的偽隨機基因組位點添加新的 TCR 基因。更廣泛地說，結合抗體結合特性和 TCR 及共刺激分子信號傳導特性的 CAR 已被設計用于將 T 細胞重定向到也在癌癥上表達的自身抗原，如 B 細胞標志物 CD19。

理論上，遺傳病的基因矯正治療可以設想未來的個性化治療，其基礎是將針對各種微生物或腫瘤抗原的抗原受體引入癌癥和傳染病患者的 T 細胞和 B 細胞，或者以消除自身免疫性疾病患者體內現(xiàn)有的針對自身抗原的 T 細胞和 B 細胞為目標。由于免疫受體庫的多樣性，這些想法的實際應用具有挑戰(zhàn)性。鑒定對特定微生物或腫瘤起作用或對特定自身抗原發(fā)生反應的 TCR、BCR 或合成抗原受體基因仍然是一項關鍵挑戰(zhàn)。鑒于目前人們對 T 細胞和 B 細胞抗原受體測序的巨大興趣和進展，隨著足夠大的受體序列數(shù)據(jù)庫的建立，這些挑戰(zhàn)有可能被克服。

微生物宏基因組

與線粒體和核基因組相比，人體內蛋白質家族多樣性最復雜的遺傳區(qū)室不是位于人體細胞內，而是位于普遍存在的微生物群的宏基因組中。在人體組織中，成年人的微生物組包含來自大約 1,000 個獨特物種的超過 30 萬億個細菌細胞。不同的解剖位置具有不同的微生物組，并且根據(jù)部位、個體、時間和疾病狀態(tài)的不同，其多樣性程度也不同。平均每個細菌含有大約 3,000 個蛋白質編碼基因，單個人的整體微生物宏基因組可能包含大約一百萬種獨特的基因產物。微生物宏基因組直到出生后才獲得，最初主要通過陰道傳遞、皮膚接觸和母乳喂養(yǎng)從母親那里遺傳。人類宏基因組的遺傳內容在個體生命中和個體之間也比線粒體或核基因組更加多樣化。兩個隨機個體之間的微生物組可能存在超過一半的內容差異（盡管在共享當?shù)丨h(huán)境和飲食的同居人類中差異要小得多），而兩個無血緣關系的個體之間的核遺傳內容差異平均約為 0.1%。

傳統(tǒng)上，通過直接離體培養(yǎng)生物體或引入動物宿主后檢測特定疾病來測量微生物組中特定致病微生物成分的存在與否。聚合酶鏈式反應等核酸特異性方法提供了更高的速度和靈活性，可以從可能擁有致病毒素基因的細菌物種中差異地檢測出這些基因。在更大規(guī)模上，16S 核糖體測序利用核糖體 RNA 的進化保守性來直接測量微生物物種多樣性。16S 宏基因組測序最早始于 20 世紀 70 年代，后來通過與下一代測序相結合而得到擴展，可快速確定人類微生物組的屬級多樣性。隨著測序成本的進一步下降，宏基因組 DNA 樣本的大量片段化和通過計算組裝成物種特異性基因組和轉錄組，越來越多地允許對宏基因組區(qū)室進行確定性采樣。

由于分子技術有助于識別不可培養(yǎng)的微生物，研究人員假設人類微生物組的改變與各種疾病的發(fā)展有關，這提出了操縱微生物組及其遺傳產物可能成為這些疾病的治療策略的可能性。到目前為止，臨床上唯一廣泛應用的針對微生物組的治療方法是，在艱難梭菌誘發(fā)的偽膜性結腸炎中，通過糞便移植大量替換耗盡的微生物組。也有人提出，炎癥性腸病和其他炎癥和代謝性疾病中存在微生物組異常。菌群失調的廣義概念認為，微生物組的性質和多樣性的改變是這些疾病的誘發(fā)因素。為了使用遺傳方法恢復多樣性，有必要識別受到干擾的特定生物，以及可能導致疾病的生物基因。

可以很容易地使細菌在基因組外質粒上表達外源基因，但由于體內不存在傳統(tǒng)實驗室選擇壓力，可能需要直接編輯細菌基因組以維持表達。通過噬菌體載體或整合質粒進行非靶向基因添加以及使用 CRISPR/Cas9 和其他可靶向工具進行基因編輯，已經(jīng)能夠在人類微生物組的細菌物種中在體外發(fā)生大規(guī)?？蛇z傳改變。在常見的核遺傳疾病苯丙酮尿癥中，一種經(jīng)過基因改造可遺傳表達苯丙氨酸代謝酶的大腸桿菌Nissle 菌株在口服后表現(xiàn)出持續(xù)植入小鼠和靈長類動物微生物組并改善血液苯丙氨酸水平。體外編輯的微生物群落可以像未編輯的治療性細菌物種一樣引入正常菌群。通過針對工程菌株進行有針對性的營養(yǎng)支持，可進一步增強植入效果。

隨著將基因編輯試劑靶向體內特定微生物物種的遞送方法的改進，這些治療性微生物基因改變最終可能在體內實現(xiàn)，類似于針對體細胞基因組和適應性免疫受體庫的體內基因療法的目標。噬菌體顯著的物種特異性使得能夠遞送針對致病菌株甚至特定抗生素耐藥質粒進行破壞的基因編輯試劑，并且可能還允許添加基因療法。無論是通過大量更換微生物組、對特定細菌物種進行體外或體內基因編輯，還是重現(xiàn)對正常菌群的生理暴露，改變多樣化人類宏基因組的遺傳內容都可能為未來的基因療法研究提供有希望的途徑。

關于遺傳病的基因治療策略的共識性意見

人類的主要遺傳區(qū)室在基因組大小、復雜性、遺傳性和多樣性方面各不相同。線粒體和核基因組中的種系突變常常導致發(fā)育障礙，盡管核基因組的巨大規(guī)模確保了數(shù)千種已發(fā)現(xiàn)的單基因疾病存在于不同的環(huán)境中。核基因組中體細胞突變的積累是癌癥發(fā)展的基礎，而線粒體中的體細胞突變可能導致衰老。更廣泛地說，微生物宏基因組主要在出生后發(fā)展，其特點是人類之間的多樣性更大，并且在生命過程中變化很大。下一代 DNA 測序的進展使線粒體測序、臨床外顯子組和全基因組測序以及 16S 和無偏微生物測序得到廣泛應用。

這些測序方法揭示的基因變異是基因療法的可糾正目標。通過使用現(xiàn)代輔助生殖技術，包括線粒體替代療法和植入前診斷，可以批量處理整個基因組區(qū)室，例如線粒體和核基因組。附加體細胞基因療法始于病毒載體的開發(fā)，用于感染可在體外培養(yǎng)的人體細胞，例如 T 細胞，并迅速發(fā)展到包括具有特定組織向性的病毒假型的體內應用。最近，CRISPR/Cas9 和相關可靶向基因編輯應用的重大進展，其中特定的致病突變或基因在其內源性位點得到糾正，為更精細的體外和體內基因療法拓展了視野。

總體而言，過去 20 年來 DNA 測序成本的大幅下降加速了遺傳病的診斷。與這些診斷進展相呼應的是，2010 年代靶向基因編輯的意外快速發(fā)展，現(xiàn)在已使設計和測試用于糾正遺傳變化的特定治療試劑變得直接且易于獲取?；虔煼◤V泛應用面臨的最大持續(xù)挑戰(zhàn)之一在于通用平臺，用于將可定制的基因編輯試劑遞送到患者特定遺傳病的目標細胞類型和基因組區(qū)室中（圖 3）。除了直接糾正遺傳病外，快速發(fā)現(xiàn)能夠增強癌癥和自身免疫等疾病細胞功能的合成遺傳回路的新方法有望在工程體細胞中進一步應用基因治療。人類遺傳區(qū)室中的遺傳病越來越容易被診斷出來，針對每個區(qū)的下一代基因治療平臺將提供靈活和個性化的治療方案。

要點總結

1. 人類含有不同的遺傳部分：線粒體基因組；核基因組（包括專門細胞中的適應性免疫受體庫）和微生物宏基因組。

2. 針對每個領域的基因療法基于三大類：受影響基因組的批量替換或選擇、非靶向添加新的遺傳信息以彌補遺傳錯誤，以及直接基因編輯以糾正致病的遺傳變異。

3. 線粒體和核基因組在受孕時就已確定，并且在整個生命過程中保持一致，但體細胞突變的積累和適應性免疫受體庫除外。遺傳病主要由突變引起。

4. 通過新一代測序診斷遺傳病和設計矯正基因治療試劑目前正被廣泛采用。將基因添加或基因編輯試劑與通用遞送平臺配對以針對體內特定體細胞類型的特定遺傳區(qū)室仍然是一項艱巨的挑戰(zhàn)。