【佳學(xué)基因檢測(cè)】準(zhǔn)確全面進(jìn)行馬凡氏綜合征基因檢測(cè)的方法與例子

佳學(xué)基因檢測(cè)導(dǎo)讀

原纖維蛋白-1 和原纖維蛋白-2 分別由FBN1和FBN2編碼，在彈性纖維組裝中發(fā)揮重要作用，其致病變異可導(dǎo)致多種結(jié)締組織疾病，如馬凡氏綜合征 (MFS) 和先天性攣縮性蜘蛛指癥 (CCD)。不同的基因組變異可能導(dǎo)致異質(zhì)性表型特征和功能后果，因此不同患者會(huì)有不同的表現(xiàn)形式，這是錯(cuò)診、誤診的重要原因?；蚪獯a技術(shù)是一種新型的基于高通量測(cè)序的基因疾病病因鑒定技術(shù)，其特點(diǎn)是可以查出新的變異，數(shù)據(jù)庫(kù)中未收錄的變異，從而在幅度降低假陰性結(jié)果。可靠的變異結(jié)果可能指導(dǎo)對(duì)患者的護(hù)理并為其家人提供遺傳咨詢(xún)。馬方氏基因檢測(cè)對(duì)兩名患有復(fù)雜先天性心臟缺陷的新生兒進(jìn)行了臨床表型分析。對(duì)于基因馬方癥基因解碼基因檢測(cè)，馬方氏基因檢測(cè)采用了新一代測(cè)序策略，包括對(duì)患有瓣膜功能不全、主動(dòng)脈竇擴(kuò)張、腎積水和畸形特征的嬰兒 A 進(jìn)行全基因組單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 微陣列，以及對(duì)患有大動(dòng)脈右位轉(zhuǎn)位 (D-TGA) 和父母雙方的嬰兒 B 進(jìn)行 Trio 全外顯子組測(cè)序 (WES)。嬰兒 A 是一名足月男嬰，具有新生兒馬凡氏綜合征特征、左側(cè)腎積水和復(fù)雜的先天性心臟缺陷，包括三尖瓣返流、主動(dòng)脈竇擴(kuò)張、卵圓孔未閉、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉、二尖瓣返流、三尖瓣返流、主動(dòng)脈瓣返流和肺竇擴(kuò)張。他出現(xiàn)了嚴(yán)重的持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓和惡化的急性高碳酸性低氧血癥性呼吸衰竭，并于生命第 10 天在同情拔管后死亡。細(xì)胞基因組全基因組 SNP 微陣列分析顯示，F(xiàn)BN1基因內(nèi)第 7-30 個(gè)外顯子存在缺失，與新生兒馬凡氏綜合征相關(guān)的外顯子缺失熱點(diǎn)區(qū)域重疊。嬰兒 B 是一名足月男性，產(chǎn)前診斷為孤立性 D-TGA。他在生命第 0 天需要進(jìn)行球囊房間隔造口術(shù)，隨后在生命第 5 天需要進(jìn)行心房轉(zhuǎn)換手術(shù)、房間隔缺損修復(fù)和動(dòng)脈導(dǎo)管未閉結(jié)扎術(shù)。Trio-WES 顯示FBN2基因中存在復(fù)合雜合 c.518C>T 和 c.8230T>G 變異。接合性分析證實(shí)，每個(gè)變異都遺傳自健康的雜合攜帶者父母之一。自從他出生時(shí)接受心臟修復(fù)手術(shù)后，他一直健康地成長(zhǎng)和發(fā)育，無(wú)需進(jìn)一步住院治療。馬方氏基因檢測(cè)的馬方癥基因解碼基因檢測(cè)重點(diǎn)介紹了新的FBN1/FBN2變異，并表明了患有復(fù)雜先天性心臟缺陷（有畸形特征和無(wú)畸形特征）的兩個(gè)嬰兒的表型-基因型關(guān)聯(lián)。這些發(fā)現(xiàn)表明，下一代高通量基因組學(xué)對(duì)于新變異檢測(cè)的重要性以及與FBN1/FBN2變異相關(guān)的表型變異性，特別是在新生兒時(shí)期，這可能會(huì)對(duì)臨床護(hù)理和家庭咨詢(xún)產(chǎn)生重大影響。

《準(zhǔn)確全面進(jìn)行馬凡氏綜合征基因檢測(cè)的方法與例子》關(guān)鍵詞

馬凡氏綜合征 (MFS)、新生兒馬凡氏綜合征 (nMFS)、先天性攣縮性蜘蛛指畸形 (CAA)、大動(dòng)脈右位轉(zhuǎn)位 (D-TGA)、全外顯子組測(cè)序 (WES)、全基因組 SNP 微陣列

佳學(xué)基因?yàn)槭裁匆瞥鲴R凡氏綜合征基因檢測(cè)

原纖維蛋白是一種富含半胱氨酸的大型糖蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 的主要成分，可融合成微纖維。原纖維蛋白微纖維是可延展的聚合物，可提供結(jié)締組織彈性，廣泛分布于組織和器官中。它們?cè)趶椥岳w維形成過(guò)程中充當(dāng)彈性蛋白沉積的模板，對(duì)維持血管、肺、皮膚和眼韌帶等組織的完整性至關(guān)重要 。原纖維蛋白-1 中有一個(gè)富含脯氨酸的小結(jié)構(gòu)域，而原纖維蛋白-2 中則有一個(gè)富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)域，這是原纖維蛋白-1 和原纖維蛋白-2 之間的主要區(qū)別。佳學(xué)基因基于《人類(lèi)疾病發(fā)生的基因序列人體組分的結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ)》，明確這些結(jié)構(gòu)域在基質(zhì)組裝中的重要性，指出每種原纖維蛋白都由特定基因編碼。兩個(gè)原纖維蛋白基因FBN1和FBN2分別編碼的蛋白質(zhì)有 71.2% 的相似性，但可能在 ECM 形成中發(fā)揮不同的重要作用，這可能是不同表型表達(dá)的基礎(chǔ)（表 1）。

表 1.與FBN1和FBN2致病變異相關(guān)的臨床特征

以下是將內(nèi)容翻譯并以表格形式呈現(xiàn)的結(jié)果：

縮寫(xiě)說(shuō)明：AD：常染色體顯性遺傳;CCA：先天性攣縮性蜘蛛指（趾）;FBN1：原纖維蛋白-1;FBN2：原纖維蛋白-2;MOI：遺傳模式;MFS：馬凡綜合征

編碼原纖維蛋白-1 ( FBN1 : MIM:134797) 的基因包含 65 個(gè)外顯子，覆蓋 200 kb 的基因組 DNA，位于 15q21.1 染色體上。原纖維蛋白-1 含有 47 個(gè)與人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子 (EGF) 相似的基序。在這 47 個(gè) EGF 樣基序中，共有 43 個(gè)呈現(xiàn)鈣結(jié)合共識(shí)序列 (cbEGF) 。每個(gè)基序由六個(gè)半胱氨酸殘基組成，這些半胱氨酸殘基在 C1 和 C3、C2 和 C4 以及 C5 和 C6 之間形成二硫鍵，從而為其三維結(jié)構(gòu)提供穩(wěn)定性 （圖 1）。鈣與 cbEGF 結(jié)構(gòu)域的結(jié)合為原纖維蛋白-1 提供了增強(qiáng)的穩(wěn)定性、防止蛋白水解以及與 ECM 的多種成分進(jìn)行通訊的結(jié)構(gòu)元素 。這些鈣結(jié)合 EGF 樣基序的寬片段被由七個(gè)此類(lèi)基序組成的一些重要結(jié)構(gòu)域所打斷，與潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1 結(jié)合蛋白 (LTBP) 相似。

圖 1.FBN1和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域示意圖

FBN1致病變異會(huì)損害微纖維的形成，從而導(dǎo)致異常結(jié)締組織的產(chǎn)生，從而引發(fā)馬凡氏綜合征 (MFS) (MIM:154700) ，這是由FBN1致病變異引起的最常見(jiàn)的遺傳性疾病（表 1）。

FBN2基因位于 5q23-3 染色體上，長(zhǎng)度超過(guò) 28 kb，有 65 個(gè)外顯子，是在克隆位于 15q15-21.3 的FBN1基因座時(shí)確定的，該基因編碼原纖維蛋白-2，這是一種含有 2912 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，具有五個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，長(zhǎng)度與原纖維蛋白-1 相似。主要結(jié)構(gòu)區(qū)包含 41 個(gè)鈣結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子 (cbEGF) 樣結(jié)構(gòu)域 [ 13 ]（圖 2 ）。原纖維蛋白-2 在發(fā)育早期表達(dá)，在成人組織中僅局限于骨和軟骨基質(zhì)，對(duì)彈性纖維的形成至關(guān)重要。FBN2 基因與FBN1具有很高的相似性；因此，據(jù)《人體心臟相關(guān)疾病的基因基礎(chǔ)》，F(xiàn)BN2的致病變異會(huì)導(dǎo)致一種表型相關(guān)的疾病，稱(chēng)為先天性契約性蜘蛛指癥 (CCA) (MIM:121050)（表 1），這種疾病也表現(xiàn)為馬凡氏病體型和蜘蛛指癥。由于 CCA 和 MFS 的表型相似，確定發(fā)病率和患病率已被證明是徒勞的。在此，馬方氏基因檢測(cè)描述了兩例與FBN1和FBN2新變異相關(guān)的纖維蛋白病的表型特征和遺傳變異。

圖 2.FBN2和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域示意圖

馬凡氏基因檢測(cè)過(guò)程、結(jié)果與分析解讀結(jié)果

1、病史和臨床病程

（1）案例A

患兒 A 出生于一家外地醫(yī)院，母親為 31 歲，來(lái)自于河北。妊娠 39 周，體重 3780 克?；颊叩漠a(chǎn)前病史包括早產(chǎn)心房收縮 (PAC) 以及左側(cè)輸尿管腎積水。嬰兒通過(guò)預(yù)定的重復(fù)低位橫切口剖宮產(chǎn)出生，出生后 1 分鐘和 5 分鐘的阿普伽評(píng)分分別為 3 分和 7 分。最初，他肌張力低下，沒(méi)有哭聲，心率約為 100 次/分。盡管最初以持續(xù)氣道正壓通氣 (CPAP) 復(fù)蘇至 100% 氧氣補(bǔ)充，但嬰兒仍然肌張力低下、屈曲姿勢(shì)和去氧飽和，并伴有微弱的低沉哭聲。他還聽(tīng)到了響亮的 4/6 全收縮期和舒張期雜音，并伴有明顯的震顫。其余體格檢查結(jié)果顯示，患者膚色暗淡、皮疹、大頭畸形、耳朵折疊且有皺紋、下頜緊咬、手指細(xì)長(zhǎng)、雙手緊握、身體姿勢(shì)彎曲、手掌和腳底沒(méi)有皺紋、腳和腳趾細(xì)長(zhǎng)、胸腔形狀異常（圖 3 A-C）。

圖 3.受檢患兒 A 的臨床特征提示新生兒馬凡氏綜合征

嬰兒被送入新生兒重癥監(jiān)護(hù)室 (NICU) 接受心肺支持。他的胸部 X 光檢查顯示嚴(yán)重的心臟擴(kuò)大（圖 3C），他的動(dòng)脈血?dú)夥治?(ABG) 因嚴(yán)重酸中毒而顯著，pH 為 7.05，PaCO 2為 106 mmHg。初始出生后超聲心動(dòng)圖檢查顯示右心室中度高血壓，三尖瓣返流峰值壓力梯度 (TRPG) 升高至 49 mmHg，主動(dòng)脈竇擴(kuò)張中度至重度 (Z = +6.5)，以及通過(guò)卵圓孔未閉 (PFO) 的雙向心房分流、通過(guò)動(dòng)脈導(dǎo)管未閉 (PDA) 的少量左向右分流、輕度至中度二尖瓣返流 (MR)、中度三尖瓣返流、輕度主動(dòng)脈瓣返流和中度至重度肺竇擴(kuò)張。盡管進(jìn)一步使用了血管加壓藥、氫化可的松、表面活性劑和廣譜抗生素治療，他仍然持續(xù)出現(xiàn)嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓 (PPHN) 和低氧血癥高碳酸性呼吸衰竭，平均氧指數(shù) (OI) 為 60，因此在出生后第 3 天 (DOL) 被轉(zhuǎn)移到馬方氏基因檢測(cè)的 NICU 進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估和治療。

盡管將他的呼吸支持升級(jí)為機(jī)械通氣并開(kāi)始吸入一氧化氮以降低肺壓，但他仍然低氧血癥，平均氧飽和度水平約為 85%。DOL 3 的重復(fù)超聲心動(dòng)圖顯示嚴(yán)重的三尖瓣反流伴脫垂、中度至重度主動(dòng)脈竇擴(kuò)張（Z = +8.1）、嚴(yán)重的肺竇擴(kuò)張以及新的左心室收縮期縮短輕度減弱（圖 3D）。在腹部、腎臟和膀胱超聲檢查中，根據(jù)胎兒泌尿外科協(xié)會(huì) (SFU) 分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)他患有 3 級(jí)左側(cè)腎積水，無(wú)輸尿管積水（圖 3E）。他的 PPHN 對(duì)前列環(huán)素（曲前列尼爾、依前列醇）和西地那非有抵抗力。盡管進(jìn)行了最大限度的藥物治療，但他仍然出現(xiàn)去氧飽和和低血壓。根據(jù)其父母的要求，他的護(hù)理被轉(zhuǎn)向患者的舒適護(hù)理。在 DOL 10 時(shí)，根據(jù)父母的要求，他在同情拔管后去世。圖 4顯示了先證者 A 的臨床病程摘要。

圖 4.患兒 A 的臨床時(shí)間過(guò)程總結(jié)

（2） 案例B

患兒B的母親為34歲的G4P2西班牙裔，孕期38周3天，體重3410克?；颊咴谠?0周時(shí)通過(guò)胎兒超聲心動(dòng)圖被產(chǎn)前診斷為大動(dòng)脈右位轉(zhuǎn)位(D-TGA)。嬰兒通過(guò)正常的自然陰道分娩出生。生后1分鐘和5分鐘的阿普伽評(píng)分分別為9分和9分。嬰兒出生時(shí)自發(fā)哭鬧，生后5分鐘仍出現(xiàn)明顯的發(fā)紺。在NICU，他最初表現(xiàn)為反常低氧血癥(即下肢氧飽和度高于上肢氧飽和度)。入院時(shí)胸部X光檢查顯示中度心臟擴(kuò)大(圖5A )，初始超聲心動(dòng)圖顯示PFO非常小，心房水平分流最小。鑒于已知 D-TGA 的情況下持續(xù)存在低氧血癥，決定進(jìn)行床邊球囊房間隔造口術(shù) (BAS)，同時(shí)持續(xù)輸注前列腺素 E1 (PGE1) 以維持導(dǎo)管通暢，并計(jì)劃在出生后第一周進(jìn)行心房轉(zhuǎn)換手術(shù) (ASO)。患者耐受了房間隔造口術(shù)，沒(méi)有任何并發(fā)??癥，重復(fù)超聲心動(dòng)圖檢查證實(shí)動(dòng)脈導(dǎo)管較大，直徑為 5.3 毫米 (圖5B)。患者保持目標(biāo)氧飽和度，DOL 1 時(shí)停用 PGE1，DOL 2 時(shí)重復(fù)超聲心動(dòng)圖檢查，現(xiàn)在顯示動(dòng)脈導(dǎo)管縮小，直徑為 3 毫米。他的血流動(dòng)力學(xué)保持穩(wěn)定，直到 DOL 4，當(dāng)時(shí)他出現(xiàn)低氧血癥高碳酸性呼吸衰竭和低血壓，分別需要機(jī)械通氣和血管加壓藥支持。此外，在 DOL 6 時(shí)開(kāi)始進(jìn)行膿毒癥檢查和廣譜抗生素治療；他接受了 ASO、動(dòng)脈導(dǎo)管結(jié)扎和 ASD 封堵術(shù)，沒(méi)有任何并發(fā)??癥，術(shù)后入住兒科心臟重癥監(jiān)護(hù)室，使用血管加壓藥。超聲心動(dòng)圖顯示術(shù)后間歇性變化以及輕度至中度二尖瓣反流，估計(jì) RVSP 為 45 mmHg 加上右動(dòng)脈壓，右肺動(dòng)脈和左肺動(dòng)脈狹窄分別為 45 mmHg 和 35 mmHg（圖 5C）。在住院的剩余時(shí)間里，他毫無(wú)問(wèn)題地撤掉了所有心肺支持，并連續(xù)進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，直到出院時(shí) DOL 為 20。

圖 5.患兒B的臨床特征

 

兩名先證者的家族史均未發(fā)現(xiàn)近親關(guān)系或其他患病家族成員。無(wú)心臟缺陷、心律失?；蜮啦∈贰?/p>

2、基因檢查（檢測(cè)）

（1）先證者A細(xì)胞基因組全基因組SNP微陣列

該檢測(cè)旨在檢測(cè)拷貝數(shù)錯(cuò)誤（丟失或增加）的改變以及表明雜合性缺失或丟失的拷貝中性改變（純合性區(qū)域）?？截悢?shù)變異分析按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院 (ACMG) 的建議進(jìn)行。SNP 微陣列在FBN1染色體 15q21.1 的外顯子 7-30 中發(fā)現(xiàn)了 107 kb 的間質(zhì)缺失（表 2）。

表 2.通過(guò)SNP微陣列檢測(cè)到了先證者A的FBN1缺失

（2）先證者B三重全外顯子組測(cè)序

外顯子組變異分析按照 ACMG 建議進(jìn)行。總共在 216 個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了 8 個(gè)純合變異（包括一個(gè)間隔 ~6 Mb）且不被認(rèn)為重要或有貢獻(xiàn)的變異，以及 212 個(gè)罕見(jiàn)的雜合蛋白質(zhì)改變變異（VUS），這些變異具有不確定的臨床意義。使用關(guān)鍵詞先天性心臟缺陷、D-TGA、VSD（室間隔缺損）、ASD（房間隔缺損）或 PDA（動(dòng)脈導(dǎo)管未閉），從人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù) (HGMD) 和在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳 (OMIM) 生成了一個(gè)主要基因列表，未檢測(cè)到與馬方氏基因檢測(cè)患者的先天性心臟缺陷相關(guān)的顯著單核苷酸變異 (SNV) 或小缺失和插入（<10 bp）。然而，在FBN 2 中發(fā)現(xiàn)了具有不確定臨床意義的復(fù)合雜合 c.518C>T 和 c.8230T>G 變異（表 3）。

表 3.通過(guò)三重WES檢測(cè)到先證者B的FBN2復(fù)合雜合變異

基因檢測(cè)與臨床結(jié)果的綜合分析

馬方氏基因檢測(cè)對(duì)兩名嬰兒進(jìn)行了臨床表型和基因組分析，患兒 A 為 nMFS，患兒 B 為 D-TGA，F(xiàn)BN1和FBN2分別存在新變異。

1、新生兒馬凡氏綜合征（nMFS）

MFS (MIM:154700) 是一種遺傳性常染色體顯性結(jié)締組織疾病，主要表現(xiàn)在骨骼、眼部和心血管系統(tǒng)，也表現(xiàn)在肺系統(tǒng)、體膜和硬腦膜 [ 18、19、20、21 ] 。由于原纖維蛋白微纖維的普遍性，MFS 常常涉及多個(gè)器官系統(tǒng) [ 22 ]。因此，F(xiàn)BN1 致病變異也會(huì)導(dǎo)致多種雖然重疊的遺傳疾?。ㄑa(bǔ)充表 S1）。MFS 患者的臨床變異性各不相同，nMFS 綜合征是兒童早期最嚴(yán)重的表現(xiàn) [ 23 ]。2016 年，已發(fā)現(xiàn) 1318 種與 MFS 相關(guān)的不同F(xiàn)BN1致病變異；然而，只有 59 個(gè)（4.8%）病例（包括 37 個(gè)錯(cuò)義突變（2.8%））與 nMFS 相關(guān) [ 23 ]，這再次表明不同的基因型-表型關(guān)聯(lián)可能決定新生兒 MFS（nMFS）與 MFS 臨床表現(xiàn)的時(shí)間和嚴(yán)重程度 [ 23 ]。

新生兒馬凡氏綜合征 (nMFS) 是指出生時(shí)或出生后 3 個(gè)月內(nèi)確診的患者 [ 24、25、26、27 ]。早發(fā)型 MFS 是由沒(méi)有家族史的新生變異引起的，其表型在產(chǎn)前、新生兒或嬰兒期表現(xiàn)出來(lái)，早于經(jīng)典 MFS 所見(jiàn)的表型 [ 28 ] 。相關(guān)表型特征包括關(guān)節(jié)攣縮、蜘蛛指、皮膚皺褶和晶狀體異位 [ 24、25、26、27 ] 。與經(jīng)典 MFS 相反[ 23、24、25、26 ] ，二尖瓣和/或三尖瓣功能不全導(dǎo)致的充血性心力衰竭是 nMFS患者出生后2年內(nèi)死亡的主要原因。染色體異常，包括全基因缺失或外顯子缺失和重復(fù)，很少發(fā)生（3.3%），但在采用多重連接依賴(lài)探針技術(shù)和陣列分析后，已發(fā)現(xiàn)染色體異常呈上升趨勢(shì)[ 29 ]。

與其他已報(bào)告病例一樣，馬方氏基因檢測(cè)的患者表現(xiàn)出 nMFS 的主要特征，包括呼吸窘迫、先天性心臟擴(kuò)大、多瓣膜疾病、畸形特征和蜘蛛指。由于沒(méi)有家族史，臨床診斷采用表型和超聲心動(dòng)圖標(biāo)準(zhǔn)。嬰兒死亡后確認(rèn)了基因診斷。全基因組 SNP 微陣列有助于識(shí)別涉及 15q21.1 內(nèi) 15 號(hào)染色體的新型 107 kb 間質(zhì)缺失，該缺失跨越FBNI的外顯子 7-30。FBN1的這種致病變異[ NM_000138.5 ] 是新生的，之前尚未報(bào)道過(guò)。因此，馬方氏基因檢測(cè)的患者符合根特疾病分類(lèi)學(xué)中定義的 MFS 診斷標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)存在心血管、骨骼、眼部和皮膚表現(xiàn)，同時(shí)有FBN1突變或家族史[ 22 , 26 , 30 ]。盡管外顯子 24–34 中的致病變異與新生兒 MFS 中異位晶狀體的存在有關(guān)[ 31 , 32 ]，但該患者并無(wú)此特征。綜合考慮臨床特征與細(xì)胞基因組學(xué)檢測(cè)，可以確診為 nMFS。出生后第一年，急性早發(fā)型 MFS 的嬰兒死亡率為 95%，且缺乏關(guān)于第三年和第四年生存率的數(shù)據(jù)[ 28 ]。

間質(zhì)缺失區(qū)域與外顯子 24-34 部分重疊，從而刪除了FBN1基因的很大一部分，導(dǎo)致該基因的一個(gè)等位基因單倍體不足或功能喪失。馬方癥基因解碼基因檢測(cè)證實(shí)，一半正常的 FBN-1 蛋白拷貝不足以啟動(dòng)微原纖維蛋白的組裝 [ 29，33 ]。因此，假設(shè)該區(qū)域在 FBN-1 蛋白的功能中起著至關(guān)重要的作用，導(dǎo)致該病發(fā)病較早且表現(xiàn)嚴(yán)重 [ 8，34，35 ]。馬方氏基因檢測(cè)患者的表型和疾病嚴(yán)重程度也可歸因于新生兒區(qū)域（外顯子 24-34）以外其他區(qū)域的突變。大約 92% 的患病個(gè)體有患病父母，25% 的先證者有新的改變 [ 30 ]。不幸的是，患者并未同意進(jìn)行父母檢測(cè)以評(píng)估缺失的可能來(lái)源。

盡管 nMFS 是原纖維蛋白病最嚴(yán)重的形式，但其診斷困難且在基因/表型上與經(jīng)典 MFS 不同 [ 23、24、25、26 ] 。此前，多項(xiàng)報(bào)告表明，nMFS 患者的 FBN1 致病變異最有可能是新發(fā)的，主要位于外顯子 24-32，被稱(chēng)為“熱點(diǎn)”或新生兒區(qū)域 [ 8、34、35 ] 。最近，該區(qū)域變異致病的原因還被歸因于 FBN-1 蛋白水解敏感性增加以及肝素結(jié)合功能的喪失 [ 23 ]，這可能影響微纖維的排列，使其融入聚合物微纖維中，這有力地表明該區(qū)域在彈性微纖維形成中起著至關(guān)重要的作用 [ 25 ]。還有少數(shù)報(bào)告稱(chēng)，nMFS 可能是由于該區(qū)域以外的致病變異引起的，外顯子 4 中有兩次報(bào)道，外顯子 21 中有一次報(bào)道 [ 35 ]。TGFBR1 、TGFBR2、TGFB2、TGFB3、SMAD2和SMAD3等基因的遺傳變異會(huì)導(dǎo)致 Loeys-Dietz 綜合征，據(jù)報(bào)道會(huì)導(dǎo)致馬凡氏樣表型，F(xiàn)BN2和COL3A1的變異會(huì)導(dǎo)致先天性攣縮性蜘蛛指癥和 Ehlers-Danlos 綜合征 IV 型 [ 11 , 36 ]。此外，文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)，患有 MFS 表型的患者在涉及FBN1基因座的 15q21.1 染色體中存在缺失，并且其他基因也有缺失 [ 7 , 29 , 33 , 37 , 38 , 39 ]，所有這些缺失都與馬方氏基因檢測(cè)報(bào)告的導(dǎo)致 nMFS 的患者的缺失不同。

3.2. 先天性契約型蜘蛛指畸形（CCA）

FBN2中的變異與常染色體顯性遺傳 CCA 相關(guān) [MIM:121050]。FBN2 中發(fā)現(xiàn)的致病變異在一個(gè)受限域中組裝，類(lèi)似于嚴(yán)重 MFS 致病變異在FBN1中組裝的位置，主要在外顯子 23 和 32 之間 [ 14 ] ，該區(qū)域編碼 cbEGF 樣結(jié)構(gòu)域，并且可能發(fā)生在整個(gè)基因中，并且與 CCA 相關(guān)的這些致病變異的數(shù)量更多。致病變異導(dǎo)致可用于形成微纖維的 FBN-2 蛋白數(shù)量減少；因此，低水平的微纖維會(huì)降低纖維的彈性，導(dǎo)致 CCA 患者表現(xiàn)出癥狀 [ 14,16,40 ] 。目前，根據(jù)人類(lèi)基因組突變數(shù)據(jù)庫(kù) (HGMD) 的記錄，文獻(xiàn)中僅報(bào)道了 91 種與 CCA 相關(guān)的FBN2基因致病變異 [ 41 ]。此外，截至本文發(fā)表時(shí)，尚未發(fā)現(xiàn)FBN2與先天性心臟缺陷（如大動(dòng)脈右位轉(zhuǎn)位 (D-TGA)）之間的基因型-表型相關(guān)性。

CCA 患者與 nMFS 有許多共同的特征；然而，CCA 患者沒(méi)有表現(xiàn)出晶狀體異位或主動(dòng)脈根部擴(kuò)張，這是主要的區(qū)別特征 [ 12 ]。CCA 的表型在家族內(nèi)和家族間存在差異，不表現(xiàn)出地域或種族偏好 [ 42 ]。FBN2的致病變異也可能引發(fā)包括伴有主動(dòng)脈病的 MFS、馬蹄內(nèi)翻足、黃斑變性和脊柱側(cè)彎在內(nèi)的疾病[ 42 ]。

馬方氏基因檢測(cè)報(bào)告了一名FBN2基因復(fù)合雜合突變患者。根據(jù)妊娠 20 周時(shí)的胎兒超聲心動(dòng)圖，先證者 B 在產(chǎn)前被診斷為 D-TGA，并需要在 DOL 0 時(shí)進(jìn)行 BAS，隨后在 DOL 5 時(shí)進(jìn)行 ASO、ASD 修復(fù)和 PDA 結(jié)扎。在對(duì)先證者 B 及其父母進(jìn)行臨床外顯子組測(cè)序后，馬方氏基因檢測(cè)在FBN2中發(fā)現(xiàn)了新的復(fù)合雜合錯(cuò)義 c.518C>T 和 c.8230T>G (p.Tyr2744Asp) 變異。盡管FBN2中的變異與常染色體顯性 CCD 有關(guān) [ 43 ]，但文獻(xiàn)中尚未報(bào)道過(guò)這兩種變異在患有這種疾病或 CHD 的個(gè)體中出現(xiàn)。

變體 c.518C>T (p.Thr173Ile) 是從母親遺傳的，此前在一般人群中出現(xiàn)頻率較低，而變體 c.8230T>G (p.Tyr2744Asp) 是從父親遺傳的，此前在一般人群中未觀察到。這兩個(gè)突變氨基酸不位于任何已知的關(guān)鍵域。使用兩個(gè)獨(dú)立的軟件預(yù)測(cè)程序 (SIFT ( http://sift.jcvi.org/ ) 和 PolyPhen ( http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/ )) 對(duì)這兩個(gè)變體的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果并不一致。在原發(fā)基因列表和使用 HGMD 和 OMIM 注釋的基因中，未發(fā)現(xiàn)有臨床意義的 SNV 或小的缺失和插入，因此無(wú)法解釋該患者所見(jiàn)的主要臨床問(wèn)題。先證者的父母為雜合子攜帶者，沒(méi)有與患者臨床表現(xiàn)相關(guān)的纖維蛋白原病的體征，家族史也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)近親關(guān)系。

FBN2中大多數(shù)有臨床意義的突變會(huì)導(dǎo)致致病性錯(cuò)義或剪接位點(diǎn)變異，這些變異通常通過(guò)改變關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)（半胱氨酸）在編碼 EGF 樣結(jié)構(gòu)域中幾個(gè)氨基酸的基因中間部分組裝，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物受到影響 [ 43 ]。表 4總結(jié)了文獻(xiàn)中關(guān)于導(dǎo)致 CAA 并與患者未觀察到的不同心臟缺陷相關(guān)的FBN2變異的報(bào)道。此外，據(jù)報(bào)道， FBN2中的基因內(nèi)框內(nèi)缺失也會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)烈表達(dá)的突變 mRNA，這意味著編碼的縮短蛋白質(zhì)整合到 ECM 中并扭曲了原纖維蛋白 2 蛋白的正確折疊 [ 16,43 ] 。在另一份報(bào)告中，在健康個(gè)體中觀察到外顯子 1-8 內(nèi)復(fù)發(fā)性基因內(nèi)FBN2缺失。因此，這意味著單倍體不足可能不是主要的作用機(jī)制，而是FBN2突變體對(duì)野生型蛋白的顯性負(fù)效應(yīng) [ 43 ]。據(jù)馬方氏基因檢測(cè)所知，這是第一例報(bào)告患有復(fù)合雜合FBN2變異且表現(xiàn)為與 CCA 無(wú)關(guān)的 D-TGA 的患者。

表 4.文獻(xiàn)中報(bào)道了FBN2變異與CCA和先天性心臟缺陷有關(guān)

CCA：先天性攣縮性蜘蛛指癥（Congenital Contractural Arachnodactyly）

• FBN1：原纖維蛋白-1基因

• FBN2：原纖維蛋白-2基因

• NA：未知或不適用

基因檢測(cè)及基因解碼所用材料和方法

1、人類(lèi)馬方癥基因解碼基因檢測(cè)

所有人體馬方癥基因解碼基因檢測(cè)均按照加州大學(xué)洛杉磯分校 (UCLA) 機(jī)構(gòu)審查委員會(huì) (IRB) 的規(guī)定進(jìn)行。所有受試者均提供書(shū)面知情同意書(shū)以參與本馬方癥基因解碼基因檢測(cè)。電子病歷、家族史和標(biāo)本采集均通過(guò) UCLA 先天性心臟缺陷 (CHD) BioCore 按照 UCLA-IRB 批準(zhǔn)的協(xié)議進(jìn)行。所有標(biāo)本在采集后均進(jìn)行了去識(shí)別和編碼。產(chǎn)前診斷是根據(jù)連續(xù)胎兒超聲檢查和超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果確定的。臨床診斷是根據(jù)臨床特征和超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果確定的。

2、細(xì)胞基因組 SNP 微陣列

在加州大學(xué)洛杉磯分校臨床基因組學(xué)中心，根據(jù)臨床驗(yàn)證的 CLIA（臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案）和 CAP（美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)）驗(yàn)證方案，使用從外周血單核細(xì)胞中分離的基因組 DNA (gDNA) 對(duì)患兒 A 進(jìn)行 SNP 微陣列分析。全基因組單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 寡核苷酸陣列用于評(píng)估測(cè)試樣本中的拷貝數(shù)變異 (CNV)、插入、缺失、重復(fù)和基因組失衡。該檢測(cè)使用 Affymetrix 全基因組 SNP 陣列 CytoScan™ HD（美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆 ThermoFisher Scientific）將患兒 A 的 DNA 與內(nèi)部參考和來(lái)自 380 名正常對(duì)照的外部參考進(jìn)行比較，以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和比較分析。該陣列平臺(tái)包含 260 萬(wàn)個(gè)用于 CNV 檢測(cè)的標(biāo)記，其中 75 萬(wàn)個(gè)為基因型 SNP，190 萬(wàn)個(gè)為非多態(tài)性探針，可實(shí)現(xiàn)全基因組覆蓋。分析使用 Affymetrix 染色體分析套件 (ChAS) 軟件版本 3.1.0.15 (r9069) 進(jìn)行。

3、Trio 全外顯子組測(cè)序 (WES)

使用標(biāo)準(zhǔn)方法（Purelink 基因組 DNA 微型試劑盒，Invitrogen，美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆）從 UCLA 先天性心臟缺陷 BioCore 的外周血單核細(xì)胞 (PBMC) 中提取基因組 DNA。使用 CLIA 驗(yàn)證的方案，在 CCRD（加州罕見(jiàn)病中心）和 UCLA 臨床基因組學(xué)中心進(jìn)行文庫(kù)制備、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。根據(jù) Agilent Sure Select Human All Exon 50 Mb（Agilent Technologies，美國(guó)加利福尼亞州圣克拉拉）Illumina 雙端測(cè)序文庫(kù)制備方案，對(duì)來(lái)自患兒和父母的基因組 DNA（3 µg）樣本進(jìn)行文庫(kù)制備和外顯子組捕獲。在 Illumina HiSeq4000（Illumina，美國(guó)加利福尼亞州圣地亞哥）上以 50 bp 雙端運(yùn)行進(jìn)行測(cè)序。對(duì)于每個(gè)樣本，生成了約 2 億個(gè)獨(dú)立配對(duì)讀取，平均覆蓋率為 RefSeq 蛋白質(zhì)編碼外顯子和側(cè)翼內(nèi)含子 (+/- 2 bp) 的 140X，其中至少 95% 的堿基在 ≥10X 時(shí)被覆蓋。使用 Novoalign 函數(shù)將序列與 hg19/b37 基因組發(fā)布比對(duì)。使用 Picard 標(biāo)記 PCR 重復(fù)?；蚪M分析工具包 (GATK) 用于插入/缺失重新比對(duì)和堿基質(zhì)量重新校準(zhǔn)。使用 GATK 統(tǒng)一基因分型器調(diào)用 SNV (單核苷酸變異) 和小 INDEL (插入和缺失)。所有變異均使用 Ensembl 的定制 VEP (變異效應(yīng)預(yù)測(cè)器) 引擎進(jìn)行注釋。使用 PLINK 確定血統(tǒng)純合區(qū)域。公共數(shù)據(jù)庫(kù)中次要等位基因頻率 <1% 的罕見(jiàn)變異被保留以供進(jìn)一步分析。

4、 變體分析

按照 ACMG/AMP 序列變異解釋指南，根據(jù)候選稀有變異的接合性和遺傳模式、其在基因內(nèi)的位置、保守評(píng)分、群體和等位基因頻率 (ClinVar)、蛋白質(zhì)水平和結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果、計(jì)算機(jī)工具的致病性預(yù)測(cè)、功能馬方癥基因解碼基因檢測(cè)和動(dòng)物模型的證據(jù)以及疾病譜進(jìn)行分類(lèi)。所有變異均根據(jù)患者的表型進(jìn)行解釋。如果預(yù)測(cè)變異具有耐受性（對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能影響較?。┗蛞言?GnomAD 數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)告，則將其排除。最后，使用 Integrative Genomics Viewer (IGV) v2.16.0確認(rèn)候選變異的技術(shù)質(zhì)量。

5. 基因檢測(cè)的結(jié)果及意義

馬方癥基因解碼基因檢測(cè)報(bào)告了先證者 A 中首次發(fā)生的新型間質(zhì)FBN1缺失。間質(zhì)缺失對(duì)蛋白質(zhì)的正常功能有重大影響，導(dǎo)致嚴(yán)重的 nMFS。馬方氏基因檢測(cè)患者所見(jiàn)的表型特征表明 nMFS 患者的基因型-表型關(guān)聯(lián)，并詳細(xì)說(shuō)明了與 nMFS 臨床特征相關(guān)的信息。雖然馬方氏基因檢測(cè)沒(méi)有在先證者 B 中觀察到 CCA 形式的原纖維蛋白病，但已報(bào)告FBN2突變中存在復(fù)雜的先天性心臟缺陷 (CCHD)。然而， FBN2變體中單獨(dú)的 D-TGA 的意義仍有待觀察，因?yàn)檫@種圓錐動(dòng)脈病變通常與任何遺傳異常或家族遺傳模式無(wú)關(guān)。因此，F(xiàn)BN2復(fù)合雜合變體 c.518C>T 和 c.8230T>G（目前被歸類(lèi)為 VUS）可能共同代表一種可能的基因型-表型相關(guān)性。