【佳學基因檢測】準確全面進行馬凡氏綜合征基因檢測的方法與例子

佳學基因檢測導讀

原纖維蛋白-1 和原纖維蛋白-2 分別由FBN1和FBN2編碼，在彈性纖維組裝中發(fā)揮重要作用，其致病變異可導致多種結締組織疾病，如馬凡氏綜合征 (MFS) 和先天性攣縮性蜘蛛指癥 (CCD)。不同的基因組變異可能導致異質性表型特征和功能后果，因此不同患者會有不同的表現(xiàn)形式，這是錯診、誤診的重要原因?；蚪獯a技術是一種新型的基于高通量測序的基因疾病病因鑒定技術，其特點是可以查出新的變異，數(shù)據(jù)庫中未收錄的變異，從而在幅度降低假陰性結果?？煽康淖儺惤Y果可能指導對患者的護理并為其家人提供遺傳咨詢。馬方氏基因檢測對兩名患有復雜先天性心臟缺陷的新生兒進行了臨床表型分析。對于基因馬方癥基因解碼基因檢測，馬方氏基因檢測采用了新一代測序策略，包括對患有瓣膜功能不全、主動脈竇擴張、腎積水和畸形特征的嬰兒 A 進行全基因組單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 微陣列，以及對患有大動脈右位轉位 (D-TGA) 和父母雙方的嬰兒 B 進行 Trio 全外顯子組測序 (WES)。嬰兒 A 是一名足月男嬰，具有新生兒馬凡氏綜合征特征、左側腎積水和復雜的先天性心臟缺陷，包括三尖瓣返流、主動脈竇擴張、卵圓孔未閉、動脈導管未閉、二尖瓣返流、三尖瓣返流、主動脈瓣返流和肺竇擴張。他出現(xiàn)了嚴重的持續(xù)性肺動脈高壓和惡化的急性高碳酸性低氧血癥性呼吸衰竭，并于生命第 10 天在同情拔管后死亡。細胞基因組全基因組 SNP 微陣列分析顯示，F(xiàn)BN1基因內第 7-30 個外顯子存在缺失，與新生兒馬凡氏綜合征相關的外顯子缺失熱點區(qū)域重疊。嬰兒 B 是一名足月男性，產(chǎn)前診斷為孤立性 D-TGA。他在生命第 0 天需要進行球囊房間隔造口術，隨后在生命第 5 天需要進行心房轉換手術、房間隔缺損修復和動脈導管未閉結扎術。Trio-WES 顯示FBN2基因中存在復合雜合 c.518C>T 和 c.8230T>G 變異。接合性分析證實，每個變異都遺傳自健康的雜合攜帶者父母之一。自從他出生時接受心臟修復手術后，他一直健康地成長和發(fā)育，無需進一步住院治療。馬方氏基因檢測的馬方癥基因解碼基因檢測重點介紹了新的FBN1/FBN2變異，并表明了患有復雜先天性心臟缺陷（有畸形特征和無畸形特征）的兩個嬰兒的表型-基因型關聯(lián)。這些發(fā)現(xiàn)表明，下一代高通量基因組學對于新變異檢測的重要性以及與FBN1/FBN2變異相關的表型變異性，特別是在新生兒時期，這可能會對臨床護理和家庭咨詢產(chǎn)生重大影響。

《準確全面進行馬凡氏綜合征基因檢測的方法與例子》關鍵詞

馬凡氏綜合征 (MFS)、新生兒馬凡氏綜合征 (nMFS)、先天性攣縮性蜘蛛指畸形 (CAA)、大動脈右位轉位 (D-TGA)、全外顯子組測序 (WES)、全基因組 SNP 微陣列

佳學基因為什么要推出馬凡氏綜合征基因檢測

原纖維蛋白是一種富含半胱氨酸的大型糖蛋白，是細胞外基質 (ECM) 的主要成分，可融合成微纖維。原纖維蛋白微纖維是可延展的聚合物，可提供結締組織彈性，廣泛分布于組織和器官中。它們在彈性纖維形成過程中充當彈性蛋白沉積的模板，對維持血管、肺、皮膚和眼韌帶等組織的完整性至關重要 。原纖維蛋白-1 中有一個富含脯氨酸的小結構域，而原纖維蛋白-2 中則有一個富含甘氨酸的結構域，這是原纖維蛋白-1 和原纖維蛋白-2 之間的主要區(qū)別。佳學基因基于《人類疾病發(fā)生的基因序列人體組分的結構與功能基礎》，明確這些結構域在基質組裝中的重要性，指出每種原纖維蛋白都由特定基因編碼。兩個原纖維蛋白基因FBN1和FBN2分別編碼的蛋白質有 71.2% 的相似性，但可能在 ECM 形成中發(fā)揮不同的重要作用，這可能是不同表型表達的基礎（表 1）。

表 1.與FBN1和FBN2致病變異相關的臨床特征

以下是將內容翻譯并以表格形式呈現(xiàn)的結果：

縮寫說明：AD：常染色體顯性遺傳;CCA：先天性攣縮性蜘蛛指（趾）;FBN1：原纖維蛋白-1;FBN2：原纖維蛋白-2;MOI：遺傳模式;MFS：馬凡綜合征

編碼原纖維蛋白-1 ( FBN1 : MIM:134797) 的基因包含 65 個外顯子，覆蓋 200 kb 的基因組 DNA，位于 15q21.1 染色體上。原纖維蛋白-1 含有 47 個與人類表皮生長因子 (EGF) 相似的基序。在這 47 個 EGF 樣基序中，共有 43 個呈現(xiàn)鈣結合共識序列 (cbEGF) 。每個基序由六個半胱氨酸殘基組成，這些半胱氨酸殘基在 C1 和 C3、C2 和 C4 以及 C5 和 C6 之間形成二硫鍵，從而為其三維結構提供穩(wěn)定性 （圖 1）。鈣與 cbEGF 結構域的結合為原纖維蛋白-1 提供了增強的穩(wěn)定性、防止蛋白水解以及與 ECM 的多種成分進行通訊的結構元素 。這些鈣結合 EGF 樣基序的寬片段被由七個此類基序組成的一些重要結構域所打斷，與潛在轉化生長因子 β1 結合蛋白 (LTBP) 相似。

圖 1.FBN1和蛋白質結構域示意圖

FBN1致病變異會損害微纖維的形成，從而導致異常結締組織的產(chǎn)生，從而引發(fā)馬凡氏綜合征 (MFS) (MIM:154700) ，這是由FBN1致病變異引起的最常見的遺傳性疾病（表 1）。

FBN2基因位于 5q23-3 染色體上，長度超過 28 kb，有 65 個外顯子，是在克隆位于 15q15-21.3 的FBN1基因座時確定的，該基因編碼原纖維蛋白-2，這是一種含有 2912 個氨基酸的蛋白質，具有五個不同的結構域，長度與原纖維蛋白-1 相似。主要結構區(qū)包含 41 個鈣結合表皮生長因子 (cbEGF) 樣結構域 [ 13 ]（圖 2 ）。原纖維蛋白-2 在發(fā)育早期表達，在成人組織中僅局限于骨和軟骨基質，對彈性纖維的形成至關重要。FBN2 基因與FBN1具有很高的相似性；因此，據(jù)《人體心臟相關疾病的基因基礎》，F(xiàn)BN2的致病變異會導致一種表型相關的疾病，稱為先天性契約性蜘蛛指癥 (CCA) (MIM:121050)（表 1），這種疾病也表現(xiàn)為馬凡氏病體型和蜘蛛指癥。由于 CCA 和 MFS 的表型相似，確定發(fā)病率和患病率已被證明是徒勞的。在此，馬方氏基因檢測描述了兩例與FBN1和FBN2新變異相關的纖維蛋白病的表型特征和遺傳變異。

圖 2.FBN2和蛋白質結構域示意圖

馬凡氏基因檢測過程、結果與分析解讀結果

1、病史和臨床病程

（1）案例A

患兒 A 出生于一家外地醫(yī)院，母親為 31 歲，來自于河北。妊娠 39 周，體重 3780 克?；颊叩漠a(chǎn)前病史包括早產(chǎn)心房收縮 (PAC) 以及左側輸尿管腎積水。嬰兒通過預定的重復低位橫切口剖宮產(chǎn)出生，出生后 1 分鐘和 5 分鐘的阿普伽評分分別為 3 分和 7 分。最初，他肌張力低下，沒有哭聲，心率約為 100 次/分。盡管最初以持續(xù)氣道正壓通氣 (CPAP) 復蘇至 100% 氧氣補充，但嬰兒仍然肌張力低下、屈曲姿勢和去氧飽和，并伴有微弱的低沉哭聲。他還聽到了響亮的 4/6 全收縮期和舒張期雜音，并伴有明顯的震顫。其余體格檢查結果顯示，患者膚色暗淡、皮疹、大頭畸形、耳朵折疊且有皺紋、下頜緊咬、手指細長、雙手緊握、身體姿勢彎曲、手掌和腳底沒有皺紋、腳和腳趾細長、胸腔形狀異常（圖 3 A-C）。

圖 3.受檢患兒 A 的臨床特征提示新生兒馬凡氏綜合征

嬰兒被送入新生兒重癥監(jiān)護室 (NICU) 接受心肺支持。他的胸部 X 光檢查顯示嚴重的心臟擴大（圖 3C），他的動脈血氣分析 (ABG) 因嚴重酸中毒而顯著，pH 為 7.05，PaCO 2為 106 mmHg。初始出生后超聲心動圖檢查顯示右心室中度高血壓，三尖瓣返流峰值壓力梯度 (TRPG) 升高至 49 mmHg，主動脈竇擴張中度至重度 (Z = +6.5)，以及通過卵圓孔未閉 (PFO) 的雙向心房分流、通過動脈導管未閉 (PDA) 的少量左向右分流、輕度至中度二尖瓣返流 (MR)、中度三尖瓣返流、輕度主動脈瓣返流和中度至重度肺竇擴張。盡管進一步使用了血管加壓藥、氫化可的松、表面活性劑和廣譜抗生素治療，他仍然持續(xù)出現(xiàn)嚴重肺動脈高壓 (PPHN) 和低氧血癥高碳酸性呼吸衰竭，平均氧指數(shù) (OI) 為 60，因此在出生后第 3 天 (DOL) 被轉移到馬方氏基因檢測的 NICU 進行進一步評估和治療。

盡管將他的呼吸支持升級為機械通氣并開始吸入一氧化氮以降低肺壓，但他仍然低氧血癥，平均氧飽和度水平約為 85%。DOL 3 的重復超聲心動圖顯示嚴重的三尖瓣反流伴脫垂、中度至重度主動脈竇擴張（Z = +8.1）、嚴重的肺竇擴張以及新的左心室收縮期縮短輕度減弱（圖 3D）。在腹部、腎臟和膀胱超聲檢查中，根據(jù)胎兒泌尿外科協(xié)會 (SFU) 分類，發(fā)現(xiàn)他患有 3 級左側腎積水，無輸尿管積水（圖 3E）。他的 PPHN 對前列環(huán)素（曲前列尼爾、依前列醇）和西地那非有抵抗力。盡管進行了最大限度的藥物治療，但他仍然出現(xiàn)去氧飽和和低血壓。根據(jù)其父母的要求，他的護理被轉向患者的舒適護理。在 DOL 10 時，根據(jù)父母的要求，他在同情拔管后去世。圖 4顯示了先證者 A 的臨床病程摘要。

圖 4.患兒 A 的臨床時間過程總結

（2） 案例B

患兒B的母親為34歲的G4P2西班牙裔，孕期38周3天，體重3410克?；颊咴谠?0周時通過胎兒超聲心動圖被產(chǎn)前診斷為大動脈右位轉位(D-TGA)。嬰兒通過正常的自然陰道分娩出生。生后1分鐘和5分鐘的阿普伽評分分別為9分和9分。嬰兒出生時自發(fā)哭鬧，生后5分鐘仍出現(xiàn)明顯的發(fā)紺。在NICU，他最初表現(xiàn)為反常低氧血癥(即下肢氧飽和度高于上肢氧飽和度)。入院時胸部X光檢查顯示中度心臟擴大(圖5A )，初始超聲心動圖顯示PFO非常小，心房水平分流最小。鑒于已知 D-TGA 的情況下持續(xù)存在低氧血癥，決定進行床邊球囊房間隔造口術 (BAS)，同時持續(xù)輸注前列腺素 E1 (PGE1) 以維持導管通暢，并計劃在出生后第一周進行心房轉換手術 (ASO)?；颊吣褪芰朔块g隔造口術，沒有任何并發(fā)??癥，重復超聲心動圖檢查證實動脈導管較大，直徑為 5.3 毫米 (圖5B)。患者保持目標氧飽和度，DOL 1 時停用 PGE1，DOL 2 時重復超聲心動圖檢查，現(xiàn)在顯示動脈導管縮小，直徑為 3 毫米。他的血流動力學保持穩(wěn)定，直到 DOL 4，當時他出現(xiàn)低氧血癥高碳酸性呼吸衰竭和低血壓，分別需要機械通氣和血管加壓藥支持。此外，在 DOL 6 時開始進行膿毒癥檢查和廣譜抗生素治療；他接受了 ASO、動脈導管結扎和 ASD 封堵術，沒有任何并發(fā)??癥，術后入住兒科心臟重癥監(jiān)護室，使用血管加壓藥。超聲心動圖顯示術后間歇性變化以及輕度至中度二尖瓣反流，估計 RVSP 為 45 mmHg 加上右動脈壓，右肺動脈和左肺動脈狹窄分別為 45 mmHg 和 35 mmHg（圖 5C）。在住院的剩余時間里，他毫無問題地撤掉了所有心肺支持，并連續(xù)進行超聲心動圖檢查，直到出院時 DOL 為 20。

圖 5.患兒B的臨床特征

 

兩名先證者的家族史均未發(fā)現(xiàn)近親關系或其他患病家族成員。無心臟缺陷、心律失?；蜮啦∈贰?/p>

2、基因檢查（檢測）

（1）先證者A細胞基因組全基因組SNP微陣列

該檢測旨在檢測拷貝數(shù)錯誤（丟失或增加）的改變以及表明雜合性缺失或丟失的拷貝中性改變（純合性區(qū)域）?？截悢?shù)變異分析按照美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學院 (ACMG) 的建議進行。SNP 微陣列在FBN1染色體 15q21.1 的外顯子 7-30 中發(fā)現(xiàn)了 107 kb 的間質缺失（表 2）。

表 2.通過SNP微陣列檢測到了先證者A的FBN1缺失

（2）先證者B三重全外顯子組測序

外顯子組變異分析按照 ACMG 建議進行。總共在 216 個基因中發(fā)現(xiàn)了 8 個純合變異（包括一個間隔 ~6 Mb）且不被認為重要或有貢獻的變異，以及 212 個罕見的雜合蛋白質改變變異（VUS），這些變異具有不確定的臨床意義。使用關鍵詞先天性心臟缺陷、D-TGA、VSD（室間隔缺損）、ASD（房間隔缺損）或 PDA（動脈導管未閉），從人類基因突變數(shù)據(jù)庫 (HGMD) 和在線人類孟德爾遺傳 (OMIM) 生成了一個主要基因列表，未檢測到與馬方氏基因檢測患者的先天性心臟缺陷相關的顯著單核苷酸變異 (SNV) 或小缺失和插入（<10 bp）。然而，在FBN 2 中發(fā)現(xiàn)了具有不確定臨床意義的復合雜合 c.518C>T 和 c.8230T>G 變異（表 3）。

表 3.通過三重WES檢測到先證者B的FBN2復合雜合變異

基因檢測與臨床結果的綜合分析

馬方氏基因檢測對兩名嬰兒進行了臨床表型和基因組分析，患兒 A 為 nMFS，患兒 B 為 D-TGA，F(xiàn)BN1和FBN2分別存在新變異。

1、新生兒馬凡氏綜合征（nMFS）

MFS (MIM:154700) 是一種遺傳性常染色體顯性結締組織疾病，主要表現(xiàn)在骨骼、眼部和心血管系統(tǒng)，也表現(xiàn)在肺系統(tǒng)、體膜和硬腦膜 [ 18、19、20、21 ] 。由于原纖維蛋白微纖維的普遍性，MFS 常常涉及多個器官系統(tǒng) [ 22 ]。因此，F(xiàn)BN1 致病變異也會導致多種雖然重疊的遺傳疾?。ㄑa充表 S1）。MFS 患者的臨床變異性各不相同，nMFS 綜合征是兒童早期最嚴重的表現(xiàn) [ 23 ]。2016 年，已發(fā)現(xiàn) 1318 種與 MFS 相關的不同F(xiàn)BN1致病變異；然而，只有 59 個（4.8%）病例（包括 37 個錯義突變（2.8%））與 nMFS 相關 [ 23 ]，這再次表明不同的基因型-表型關聯(lián)可能決定新生兒 MFS（nMFS）與 MFS 臨床表現(xiàn)的時間和嚴重程度 [ 23 ]。

新生兒馬凡氏綜合征 (nMFS) 是指出生時或出生后 3 個月內確診的患者 [ 24、25、26、27 ]。早發(fā)型 MFS 是由沒有家族史的新生變異引起的，其表型在產(chǎn)前、新生兒或嬰兒期表現(xiàn)出來，早于經(jīng)典 MFS 所見的表型 [ 28 ] 。相關表型特征包括關節(jié)攣縮、蜘蛛指、皮膚皺褶和晶狀體異位 [ 24、25、26、27 ] 。與經(jīng)典 MFS 相反[ 23、24、25、26 ] ，二尖瓣和/或三尖瓣功能不全導致的充血性心力衰竭是 nMFS患者出生后2年內死亡的主要原因。染色體異常，包括全基因缺失或外顯子缺失和重復，很少發(fā)生（3.3%），但在采用多重連接依賴探針技術和陣列分析后，已發(fā)現(xiàn)染色體異常呈上升趨勢[ 29 ]。

與其他已報告病例一樣，馬方氏基因檢測的患者表現(xiàn)出 nMFS 的主要特征，包括呼吸窘迫、先天性心臟擴大、多瓣膜疾病、畸形特征和蜘蛛指。由于沒有家族史，臨床診斷采用表型和超聲心動圖標準。嬰兒死亡后確認了基因診斷。全基因組 SNP 微陣列有助于識別涉及 15q21.1 內 15 號染色體的新型 107 kb 間質缺失，該缺失跨越FBNI的外顯子 7-30。FBN1的這種致病變異[ NM_000138.5 ] 是新生的，之前尚未報道過。因此，馬方氏基因檢測的患者符合根特疾病分類學中定義的 MFS 診斷標準，該標準強調存在心血管、骨骼、眼部和皮膚表現(xiàn)，同時有FBN1突變或家族史[ 22 , 26 , 30 ]。盡管外顯子 24–34 中的致病變異與新生兒 MFS 中異位晶狀體的存在有關[ 31 , 32 ]，但該患者并無此特征。綜合考慮臨床特征與細胞基因組學檢測，可以確診為 nMFS。出生后第一年，急性早發(fā)型 MFS 的嬰兒死亡率為 95%，且缺乏關于第三年和第四年生存率的數(shù)據(jù)[ 28 ]。

間質缺失區(qū)域與外顯子 24-34 部分重疊，從而刪除了FBN1基因的很大一部分，導致該基因的一個等位基因單倍體不足或功能喪失。馬方癥基因解碼基因檢測證實，一半正常的 FBN-1 蛋白拷貝不足以啟動微原纖維蛋白的組裝 [ 29，33 ]。因此，假設該區(qū)域在 FBN-1 蛋白的功能中起著至關重要的作用，導致該病發(fā)病較早且表現(xiàn)嚴重 [ 8，34，35 ]。馬方氏基因檢測患者的表型和疾病嚴重程度也可歸因于新生兒區(qū)域（外顯子 24-34）以外其他區(qū)域的突變。大約 92% 的患病個體有患病父母，25% 的先證者有新的改變 [ 30 ]。不幸的是，患者并未同意進行父母檢測以評估缺失的可能來源。

盡管 nMFS 是原纖維蛋白病最嚴重的形式，但其診斷困難且在基因/表型上與經(jīng)典 MFS 不同 [ 23、24、25、26 ] 。此前，多項報告表明，nMFS 患者的 FBN1 致病變異最有可能是新發(fā)的，主要位于外顯子 24-32，被稱為“熱點”或新生兒區(qū)域 [ 8、34、35 ] 。最近，該區(qū)域變異致病的原因還被歸因于 FBN-1 蛋白水解敏感性增加以及肝素結合功能的喪失 [ 23 ]，這可能影響微纖維的排列，使其融入聚合物微纖維中，這有力地表明該區(qū)域在彈性微纖維形成中起著至關重要的作用 [ 25 ]。還有少數(shù)報告稱，nMFS 可能是由于該區(qū)域以外的致病變異引起的，外顯子 4 中有兩次報道，外顯子 21 中有一次報道 [ 35 ]。TGFBR1 、TGFBR2、TGFB2、TGFB3、SMAD2和SMAD3等基因的遺傳變異會導致 Loeys-Dietz 綜合征，據(jù)報道會導致馬凡氏樣表型，F(xiàn)BN2和COL3A1的變異會導致先天性攣縮性蜘蛛指癥和 Ehlers-Danlos 綜合征 IV 型 [ 11 , 36 ]。此外，文獻報道稱，患有 MFS 表型的患者在涉及FBN1基因座的 15q21.1 染色體中存在缺失，并且其他基因也有缺失 [ 7 , 29 , 33 , 37 , 38 , 39 ]，所有這些缺失都與馬方氏基因檢測報告的導致 nMFS 的患者的缺失不同。

3.2. 先天性契約型蜘蛛指畸形（CCA）

FBN2中的變異與常染色體顯性遺傳 CCA 相關 [MIM:121050]。FBN2 中發(fā)現(xiàn)的致病變異在一個受限域中組裝，類似于嚴重 MFS 致病變異在FBN1中組裝的位置，主要在外顯子 23 和 32 之間 [ 14 ] ，該區(qū)域編碼 cbEGF 樣結構域，并且可能發(fā)生在整個基因中，并且與 CCA 相關的這些致病變異的數(shù)量更多。致病變異導致可用于形成微纖維的 FBN-2 蛋白數(shù)量減少；因此，低水平的微纖維會降低纖維的彈性，導致 CCA 患者表現(xiàn)出癥狀 [ 14,16,40 ] 。目前，根據(jù)人類基因組突變數(shù)據(jù)庫 (HGMD) 的記錄，文獻中僅報道了 91 種與 CCA 相關的FBN2基因致病變異 [ 41 ]。此外，截至本文發(fā)表時，尚未發(fā)現(xiàn)FBN2與先天性心臟缺陷（如大動脈右位轉位 (D-TGA)）之間的基因型-表型相關性。

CCA 患者與 nMFS 有許多共同的特征；然而，CCA 患者沒有表現(xiàn)出晶狀體異位或主動脈根部擴張，這是主要的區(qū)別特征 [ 12 ]。CCA 的表型在家族內和家族間存在差異，不表現(xiàn)出地域或種族偏好 [ 42 ]。FBN2的致病變異也可能引發(fā)包括伴有主動脈病的 MFS、馬蹄內翻足、黃斑變性和脊柱側彎在內的疾病[ 42 ]。

馬方氏基因檢測報告了一名FBN2基因復合雜合突變患者。根據(jù)妊娠 20 周時的胎兒超聲心動圖，先證者 B 在產(chǎn)前被診斷為 D-TGA，并需要在 DOL 0 時進行 BAS，隨后在 DOL 5 時進行 ASO、ASD 修復和 PDA 結扎。在對先證者 B 及其父母進行臨床外顯子組測序后，馬方氏基因檢測在FBN2中發(fā)現(xiàn)了新的復合雜合錯義 c.518C>T 和 c.8230T>G (p.Tyr2744Asp) 變異。盡管FBN2中的變異與常染色體顯性 CCD 有關 [ 43 ]，但文獻中尚未報道過這兩種變異在患有這種疾病或 CHD 的個體中出現(xiàn)。

變體 c.518C>T (p.Thr173Ile) 是從母親遺傳的，此前在一般人群中出現(xiàn)頻率較低，而變體 c.8230T>G (p.Tyr2744Asp) 是從父親遺傳的，此前在一般人群中未觀察到。這兩個突變氨基酸不位于任何已知的關鍵域。使用兩個獨立的軟件預測程序 (SIFT ( http://sift.jcvi.org/ ) 和 PolyPhen ( http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/ )) 對這兩個變體的致病性進行預測，結果并不一致。在原發(fā)基因列表和使用 HGMD 和 OMIM 注釋的基因中，未發(fā)現(xiàn)有臨床意義的 SNV 或小的缺失和插入，因此無法解釋該患者所見的主要臨床問題。先證者的父母為雜合子攜帶者，沒有與患者臨床表現(xiàn)相關的纖維蛋白原病的體征，家族史也沒有發(fā)現(xiàn)近親關系。

FBN2中大多數(shù)有臨床意義的突變會導致致病性錯義或剪接位點變異，這些變異通常通過改變關鍵結合位點（半胱氨酸）在編碼 EGF 樣結構域中幾個氨基酸的基因中間部分組裝，并導致蛋白質產(chǎn)物受到影響 [ 43 ]。表 4總結了文獻中關于導致 CAA 并與患者未觀察到的不同心臟缺陷相關的FBN2變異的報道。此外，據(jù)報道， FBN2中的基因內框內缺失也會導致強烈表達的突變 mRNA，這意味著編碼的縮短蛋白質整合到 ECM 中并扭曲了原纖維蛋白 2 蛋白的正確折疊 [ 16,43 ] 。在另一份報告中，在健康個體中觀察到外顯子 1-8 內復發(fā)性基因內FBN2缺失。因此，這意味著單倍體不足可能不是主要的作用機制，而是FBN2突變體對野生型蛋白的顯性負效應 [ 43 ]。據(jù)馬方氏基因檢測所知，這是第一例報告患有復合雜合FBN2變異且表現(xiàn)為與 CCA 無關的 D-TGA 的患者。

表 4.文獻中報道了FBN2變異與CCA和先天性心臟缺陷有關

CCA：先天性攣縮性蜘蛛指癥（Congenital Contractural Arachnodactyly）

• FBN1：原纖維蛋白-1基因

• FBN2：原纖維蛋白-2基因

• NA：未知或不適用

基因檢測及基因解碼所用材料和方法

1、人類馬方癥基因解碼基因檢測

所有人體馬方癥基因解碼基因檢測均按照加州大學洛杉磯分校 (UCLA) 機構審查委員會 (IRB) 的規(guī)定進行。所有受試者均提供書面知情同意書以參與本馬方癥基因解碼基因檢測。電子病歷、家族史和標本采集均通過 UCLA 先天性心臟缺陷 (CHD) BioCore 按照 UCLA-IRB 批準的協(xié)議進行。所有標本在采集后均進行了去識別和編碼。產(chǎn)前診斷是根據(jù)連續(xù)胎兒超聲檢查和超聲心動圖檢查結果確定的。臨床診斷是根據(jù)臨床特征和超聲心動圖檢查結果確定的。

2、細胞基因組 SNP 微陣列

在加州大學洛杉磯分校臨床基因組學中心，根據(jù)臨床驗證的 CLIA（臨床實驗室改進修正案）和 CAP（美國病理學家協(xié)會）驗證方案，使用從外周血單核細胞中分離的基因組 DNA (gDNA) 對患兒 A 進行 SNP 微陣列分析。全基因組單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 寡核苷酸陣列用于評估測試樣本中的拷貝數(shù)變異 (CNV)、插入、缺失、重復和基因組失衡。該檢測使用 Affymetrix 全基因組 SNP 陣列 CytoScan™ HD（美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆 ThermoFisher Scientific）將患兒 A 的 DNA 與內部參考和來自 380 名正常對照的外部參考進行比較，以進行標準化和比較分析。該陣列平臺包含 260 萬個用于 CNV 檢測的標記，其中 75 萬個為基因型 SNP，190 萬個為非多態(tài)性探針，可實現(xiàn)全基因組覆蓋。分析使用 Affymetrix 染色體分析套件 (ChAS) 軟件版本 3.1.0.15 (r9069) 進行。

3、Trio 全外顯子組測序 (WES)

使用標準方法（Purelink 基因組 DNA 微型試劑盒，Invitrogen，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）從 UCLA 先天性心臟缺陷 BioCore 的外周血單核細胞 (PBMC) 中提取基因組 DNA。使用 CLIA 驗證的方案，在 CCRD（加州罕見病中心）和 UCLA 臨床基因組學中心進行文庫制備、測序和數(shù)據(jù)分析。根據(jù) Agilent Sure Select Human All Exon 50 Mb（Agilent Technologies，美國加利福尼亞州圣克拉拉）Illumina 雙端測序文庫制備方案，對來自患兒和父母的基因組 DNA（3 µg）樣本進行文庫制備和外顯子組捕獲。在 Illumina HiSeq4000（Illumina，美國加利福尼亞州圣地亞哥）上以 50 bp 雙端運行進行測序。對于每個樣本，生成了約 2 億個獨立配對讀取，平均覆蓋率為 RefSeq 蛋白質編碼外顯子和側翼內含子 (+/- 2 bp) 的 140X，其中至少 95% 的堿基在 ≥10X 時被覆蓋。使用 Novoalign 函數(shù)將序列與 hg19/b37 基因組發(fā)布比對。使用 Picard 標記 PCR 重復?；蚪M分析工具包 (GATK) 用于插入/缺失重新比對和堿基質量重新校準。使用 GATK 統(tǒng)一基因分型器調用 SNV (單核苷酸變異) 和小 INDEL (插入和缺失)。所有變異均使用 Ensembl 的定制 VEP (變異效應預測器) 引擎進行注釋。使用 PLINK 確定血統(tǒng)純合區(qū)域。公共數(shù)據(jù)庫中次要等位基因頻率 <1% 的罕見變異被保留以供進一步分析。

4、 變體分析

按照 ACMG/AMP 序列變異解釋指南，根據(jù)候選稀有變異的接合性和遺傳模式、其在基因內的位置、保守評分、群體和等位基因頻率 (ClinVar)、蛋白質水平和結構域的預測結果、計算機工具的致病性預測、功能馬方癥基因解碼基因檢測和動物模型的證據(jù)以及疾病譜進行分類。所有變異均根據(jù)患者的表型進行解釋。如果預測變異具有耐受性（對蛋白質結構或功能影響較?。┗蛞言?GnomAD 數(shù)據(jù)庫中報告，則將其排除。最后，使用 Integrative Genomics Viewer (IGV) v2.16.0確認候選變異的技術質量。

5. 基因檢測的結果及意義

馬方癥基因解碼基因檢測報告了先證者 A 中首次發(fā)生的新型間質FBN1缺失。間質缺失對蛋白質的正常功能有重大影響，導致嚴重的 nMFS。馬方氏基因檢測患者所見的表型特征表明 nMFS 患者的基因型-表型關聯(lián)，并詳細說明了與 nMFS 臨床特征相關的信息。雖然馬方氏基因檢測沒有在先證者 B 中觀察到 CCA 形式的原纖維蛋白病，但已報告FBN2突變中存在復雜的先天性心臟缺陷 (CCHD)。然而， FBN2變體中單獨的 D-TGA 的意義仍有待觀察，因為這種圓錐動脈病變通常與任何遺傳異?；蚣易暹z傳模式無關。因此，F(xiàn)BN2復合雜合變體 c.518C>T 和 c.8230T>G（目前被歸類為 VUS）可能共同代表一種可能的基因型-表型相關性。