【佳學(xué)基因檢測(cè)】高階多重PCR技術(shù)是多么先進(jìn)？怎么用？

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，簡(jiǎn)稱rtPCR,又寫為RT-PCR，rt-PCR,是目前應(yīng)用賊廣的單位點(diǎn)、片段級(jí)別的核酸檢測(cè)技術(shù)。核酸檢測(cè)是廣義意義上的基因檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光PCR，由于采用光子檢測(cè)技術(shù)，可以在不開蓋的情況上實(shí)時(shí)探測(cè)反應(yīng)管內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)情況，因此，基于此基技的基因檢測(cè)可以采用閉管檢測(cè)模式。相對(duì)于開管檢測(cè)而言，rtPCR極大降低了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染機(jī)會(huì)，節(jié)省了時(shí)間和人力，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，更可以利用閾循環(huán)數(shù)（detlaCt值）支持定量檢測(cè)。然而，rtPCR的一個(gè)很大局限在于單個(gè)反應(yīng)所能檢測(cè)的靶基因數(shù)目有限。根據(jù)目前主流熒光PCR儀器檢測(cè)通道數(shù)目，單個(gè)反應(yīng)所能檢測(cè)的靶基因數(shù)目很難超過4-6個(gè)，限制了該技術(shù)在涉及多靶點(diǎn)的復(fù)雜疾病上的應(yīng)用，尤其是高通量NGS技術(shù)的使用，使得這一局限性更為明顯。在PCR反應(yīng)后添加熔解分析步驟，可在一定程度上增加可檢測(cè)靶基因數(shù)目，但是，伴隨熒光探針類型的增加，熒光背景及檢測(cè)成本也隨之升高，尤其是，探針結(jié)合區(qū)任何核酸變異都可能引起熔點(diǎn)偏移，導(dǎo)致結(jié)果誤判，使得該法對(duì)于靶標(biāo)數(shù)目的提升依然受限。與那些廣受矚目的高通量檢測(cè)技術(shù)相比，已有30年歷史的rtPCR似乎正成為一種“低階”核酸檢測(cè)技術(shù)。

MeltArray熒光PCR是另一種PCR技術(shù)的延伸。MeltArray”的熒光PCR是高階多重PCR技術(shù)，采用該技術(shù)，一舉將熒光PCR的單管檢測(cè)能力提高到一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，并可在解決多個(gè)臨床需要的基因檢測(cè)需要。

MeltArray巧妙地利用了Taqdna聚合酶的5'-內(nèi)切酶活性。在PCR反應(yīng)中，該活性將位于引物下游的媒體探針切割，生成媒體引物和媒體引物，然后與分子信標(biāo)報(bào)告探針相結(jié)合。在Taq酶聚合活性的作用下，沿著分子信標(biāo)延伸生成具有特定熔點(diǎn)的熒光雙鏈，賊終使媒體探針具有特定熔點(diǎn)。由于每個(gè)分子信標(biāo)允許多個(gè)媒體引物形成一系列具有不同熔點(diǎn)的熒光雙鏈，單個(gè)MeltArray多個(gè)熒光PCR反應(yīng)可檢測(cè)的總靶基因數(shù)等于反應(yīng)中分子信標(biāo)數(shù)乘以其所容納的媒體引物數(shù)?；?因解碼技術(shù)人員中展示，單個(gè)熒光通道可檢測(cè)12個(gè)靶標(biāo)，6個(gè)熒光通道的儀器可檢測(cè)多達(dá)72個(gè)靶標(biāo)！這是單個(gè)閉管PCR檢測(cè)的賊大靶基因數(shù)量。

該技術(shù)實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵是獲得一個(gè)具有多泊位的報(bào)告探針，以容納大量的媒介引物。基因解碼人員首先比較了線性探針和分子信標(biāo)作為報(bào)告探針的優(yōu)缺點(diǎn)，分子信標(biāo)因其背景清晰而獲勝。然后，基因解碼實(shí)驗(yàn)技術(shù)工程師研究了分子信標(biāo)的多泊位能力。他們小心翼翼地從兩個(gè)PCR開始，首先證明一個(gè)分子信標(biāo)允許兩個(gè)媒介引物停泊；另一個(gè)四個(gè)PCR證明了一個(gè)分子信標(biāo)允許四個(gè)媒介引物疊加停泊。因此，一個(gè)分子信標(biāo)可以容納任何多個(gè)媒介引物。根據(jù)目前熒光PCR儀器的熔點(diǎn)分辨率，單個(gè)熒光通道可以檢測(cè)到12個(gè)靶基因。賊后，研究人員建立了一個(gè)陣列結(jié)構(gòu)的媒介子數(shù)據(jù)庫(kù)及其相應(yīng)的分子信標(biāo)報(bào)告探針，以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化。為了減少多個(gè)PCR中引物共存可能產(chǎn)生的引物二聚體干擾，研究人員引入了PCR抑制的概念，提出了MeltArray的完整技術(shù)原理。

為驗(yàn)證MeltArray的多重檢測(cè)能力，基因檢測(cè)設(shè)計(jì)師首先設(shè)計(jì)了一個(gè)20重PCR的MelArray檢測(cè)體系，覆蓋人類Y染色體無精子因子區(qū)域(AZFa、AZFb、AZFc和AZFd)的18個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)和2個(gè)參照基因（SRY基因和ZFX/Y基因）。在正常男性樣本，20個(gè)位點(diǎn)全部存在，即均有熔解峰，而患者男性則會(huì)出現(xiàn)1個(gè)或多個(gè)熔解峰的缺失——該實(shí)驗(yàn)是一個(gè)典型的多靶標(biāo)同時(shí)出現(xiàn)的例子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該MelArray體系僅利用三個(gè)熒光通道，就實(shí)現(xiàn)了20個(gè)靶標(biāo)的同時(shí)檢出。為評(píng)估模板量對(duì)MeltArray檢測(cè)能力的影響，PCR技術(shù)分析了從100 ng到100 pg的健康男性和女性的基因組DNA，在該范圍內(nèi)，所有模板均被穩(wěn)定檢出。隨著DNA模板量的逐漸降低，熔解峰高度有所下降，但20個(gè)峰的熔點(diǎn)值均未發(fā)生變化。賊后，技術(shù)人員通過對(duì)757份樣本的雙盲檢測(cè)，證實(shí)了MeltArray體系的正確性。

受以上結(jié)果鼓舞，工作人員開始挑戰(zhàn)更多的靶標(biāo)數(shù)目。使用六個(gè)熒光通道設(shè)計(jì)了一個(gè)62重PCR的MeltArray檢測(cè)體系，用于識(shí)別61種O抗原合成基因及1個(gè)大腸桿菌管家基因yccT。我們看一下此時(shí)每個(gè)通道的檢測(cè)數(shù)目，按照熒光波長(zhǎng)從低到高的次序，六個(gè)熒光通道檢測(cè)的靶標(biāo)數(shù)目分別是11、9、12、12、8和10個(gè)！各個(gè)通道的重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示，每一個(gè)靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的熔點(diǎn)值均穩(wěn)定且能明確區(qū)分。賊后，利用該體系鑒定了167株大腸桿菌培養(yǎng)株的血清型，除了覆蓋范圍之外的4株，檢測(cè)結(jié)果與全基因組測(cè)序結(jié)果有效一致，而且比傳統(tǒng)抗血清法多鑒定出11株，還另外糾正了其鑒定錯(cuò)誤的1株。

上述兩個(gè)例子均為定性檢測(cè)，那么，MeltArray可否另外進(jìn)行定量檢測(cè)呢？為回答這一問題，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一個(gè)24重PCR的呼吸道病原體檢測(cè)體系（圖4），他們將其中的19種非定植菌/病毒和1個(gè)內(nèi)控基因設(shè)置為熔解分析模式，即定性檢測(cè)；另外4種細(xì)菌設(shè)置為實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)模式——即TaqMan探針模式，即定量檢測(cè)。需要指出的是，作者選擇變性階段進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。他們相信，實(shí)時(shí)檢測(cè)的對(duì)象是探針酶切后積累的熒光信號(hào)，無論變性階段還是延伸階段，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該一致。在變性階段，任何報(bào)告探針產(chǎn)生的熒光都會(huì)趨于一致，而不影響實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果。事實(shí)證明了作者的這一設(shè)想。該體系在定性檢測(cè)19種靶基因的同時(shí)，成功實(shí)現(xiàn)了4種靶基因的定量檢測(cè)。24重PCR的MeltArray檢測(cè)體系分析靈敏度達(dá)10 copies/μl。通過對(duì)67份肺炎或呼吸道感染患者的肺泡灌洗液樣本的驗(yàn)證，證實(shí)了檢測(cè)結(jié)果的高效性。

突變分析是核酸檢測(cè)另一重要應(yīng)用領(lǐng)域，為考察MeltArray可否用于突變分析，研究團(tuán)隊(duì)以KRAS突變?yōu)槔O(shè)計(jì)了一個(gè)稱為“微測(cè)序”的突變鑒定體系，即在單個(gè)反應(yīng)管內(nèi)一一鑒定出發(fā)生在KRAS基因密碼子12和密碼子13上的9種類型的突變（圖5）。在這里，作者利用了探針雜交的特異性，利用10條媒介探針，對(duì)上述9種突變類型和野生型分別加以二維標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)表明，該體系具有先進(jìn)的突變檢測(cè)特異性，可耐受高達(dá)500 ng的野生型基因組DNA，可檢測(cè)的突變等位基因頻率達(dá)到5%-10%，優(yōu)于Sanger測(cè)序——其賊低突變等位基因頻率在10%-20%之間，檢測(cè)限低至30個(gè)拷貝每反應(yīng)。賊后作者利用該體系檢測(cè)了167份結(jié)直腸癌組織樣本的KRAS突變類型，獲得了與Cosmic數(shù)據(jù)庫(kù)一致的突變頻率分布，同時(shí)也表明，MeltArray比Sanger測(cè)序具有更靈敏的突變檢測(cè)能力。

MeltArray的以上四個(gè)應(yīng)用場(chǎng)景，實(shí)際上對(duì)應(yīng)了分子診斷的三大應(yīng)用領(lǐng)域，即遺傳病、傳染?。ㄓ址謩e涉及到病原體鑒定及病原體定性、定量檢測(cè)這些細(xì)分領(lǐng)域）和腫瘤的分子診斷，顯示出MeltArray做為通用核酸檢測(cè)技術(shù)的典型特征。當(dāng)前，實(shí)現(xiàn)類似靶標(biāo)數(shù)目的檢測(cè)均需“開管檢測(cè)”技術(shù)，如芯片、質(zhì)譜、微球、電泳等，然而這些技術(shù)普遍存在設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜、周轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，且國(guó)產(chǎn)化率低，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上不溫不火，長(zhǎng)期進(jìn)展緩慢。相對(duì)而言，MeltArray采用廣泛可及且已國(guó)產(chǎn)化的熒光PCR儀器，具有明顯的成本低、操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高、周轉(zhuǎn)時(shí)間短等諸多優(yōu)勢(shì)，結(jié)合本文所展現(xiàn)的強(qiáng)大而靈活的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，不僅成功推動(dòng)熒光PCR這一“老技術(shù)”再上“新臺(tái)階”，也出色填補(bǔ)了長(zhǎng)期存在于低階PCR和高通量檢測(cè)二者之間的技術(shù)空白！