國(guó)家藥監(jiān)局
關(guān)于發(fā)布腫瘤相關(guān)突變基因檢測(cè)試劑和CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測(cè)試劑
2項(xiàng)注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則的通告

（2019年 第83號(hào)）

為加強(qiáng)醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè)工作的監(jiān)督和指導(dǎo)，進(jìn)一步提高注冊(cè)審查質(zhì)量，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局組織制定了《腫瘤相關(guān)突變基因檢測(cè)試劑（高通量測(cè)序法）性能評(píng)價(jià)通用注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》和《CYP2C19藥物代謝酶基因多態(tài)性檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》，現(xiàn)予發(fā)布。

特此通告。

國(guó)家藥監(jiān)局2019年11月12日

腫瘤相關(guān)突變基因檢測(cè)試劑（高通量測(cè)序法）

性能評(píng)價(jià)通用技術(shù)審查指導(dǎo)原則

 

一、前言

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)試劑分析性能評(píng)價(jià)注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對(duì)腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)試劑分析性能評(píng)價(jià)的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對(duì)其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

二、適用范圍

本指導(dǎo)原則所述腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)試劑分析性能評(píng)價(jià)主要是指基于高通量測(cè)序（high-throughput sequencing）即下一代測(cè)序（next generation sequencing,  NGS），又稱為大規(guī)模平行測(cè)序（massively parallel sequencing, MPS），體外檢測(cè)人體組織中腫瘤細(xì)胞中腫瘤相關(guān)基因變異。用于檢測(cè)體細(xì)胞突變的NGS正在廣泛用于腫瘤診療相關(guān)的分子檢測(cè)，包括對(duì)特定基因的DNA/RNA進(jìn)行測(cè)序，以尋找與腫瘤臨床診療相關(guān)的突變基因的改變。腫瘤基因突變類(lèi)型包括點(diǎn)突變、插入、缺失、基因重排、拷貝數(shù)異常等廣義的基因突變。

基于NGS測(cè)序原理的IVD檢測(cè)可能包括以下步驟：樣本收集，處理和保存、DNA提取、DNA處理、文庫(kù)制備、測(cè)序和堿基識(shí)別、序列比對(duì)/映射、變異識(shí)別和過(guò)濾、變異注釋和解讀以及檢測(cè)報(bào)告的生成。同時(shí)，某些產(chǎn)品還可能會(huì)包括軟件部分，但上述相關(guān)步驟并不一定被全部包括，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的具體設(shè)計(jì)流程來(lái)進(jìn)行判斷。對(duì)于每個(gè)檢測(cè)步驟，申請(qǐng)人需要結(jié)合產(chǎn)品設(shè)計(jì)和臨床意義來(lái)建立特定的可接受的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)和合格判斷標(biāo)準(zhǔn)。此外，為滿足產(chǎn)品特定預(yù)期用途，申請(qǐng)人需通過(guò)科學(xué)和適當(dāng)?shù)臋z測(cè)性能研究來(lái)確定適用的試劑，消耗品，儀器和軟件?；谏鲜隹紤]因素，NGS檢測(cè)產(chǎn)品的設(shè)計(jì)和工作流程中的任何差異均可能導(dǎo)致結(jié)果的不同，因此申請(qǐng)人需要清楚地描述相關(guān)檢測(cè)性能指標(biāo)。

分析性能評(píng)價(jià)的初衷在于提出產(chǎn)品性能有效性、安全性相關(guān)問(wèn)題的假設(shè)，然后通過(guò)研究進(jìn)行確認(rèn)。NGS在測(cè)序通量及發(fā)現(xiàn)未知基因變異方面具有優(yōu)勢(shì)，但是在NGS技術(shù)應(yīng)用需求及使用中存在包括相關(guān)臨床樣本收集處理、NGS檢測(cè)內(nèi)容、測(cè)序流程、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告、技術(shù)質(zhì)量認(rèn)證和驗(yàn)證等各方面的挑戰(zhàn)。

本指導(dǎo)原則將重點(diǎn)關(guān)注實(shí)體瘤中檢測(cè)具有臨床意義的體細(xì)胞變異和盡力做到高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果。申請(qǐng)人應(yīng)以患者的利益為中心，充分整合臨床腫瘤學(xué)家對(duì)于正確診治的觀點(diǎn)，并充分考慮在我國(guó)推廣應(yīng)用的可操作性。申請(qǐng)人可采用多樣化的靶向基因組合檢測(cè)。由靶向基因組產(chǎn)生的信息可能會(huì)被用于診斷分類(lèi)，指導(dǎo)治療決策，和/或?yàn)樘囟[瘤提供預(yù)后評(píng)價(jià)，不同產(chǎn)品包含的基因數(shù)量可能存在較大差異。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行新穎注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。本指導(dǎo)原則不適用于基于胚系來(lái)源檢測(cè),全外顯子檢測(cè)，腫瘤突變負(fù)荷（TMB）檢測(cè)，非靶向測(cè)序，從頭測(cè)序、微生物感染輔助診斷、游離DNA檢測(cè)、直接面向消費(fèi)者測(cè)序、胎兒檢測(cè)、微生物基因組鑒定和藥物耐藥性檢測(cè)、胚胎植入前檢測(cè)、疾病風(fēng)險(xiǎn)（含遺傳風(fēng)險(xiǎn)) 評(píng)估與預(yù)測(cè)、RNA直接測(cè)序、篩查、獨(dú)立診斷目的、腫瘤基因組測(cè)序、健康個(gè)體測(cè)序檢測(cè)。

三、NGS性能評(píng)價(jià)

(一)綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及同類(lèi)產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。

作為IVD檢測(cè)一般原則，申請(qǐng)人應(yīng)首先定義申報(bào)產(chǎn)品的預(yù)期用途和檢測(cè)性能，產(chǎn)品的預(yù)期用途將直接影響檢測(cè)設(shè)計(jì)和檢測(cè)性能以及測(cè)序和/或報(bào)告的基因類(lèi)型。申請(qǐng)人需要前瞻性地確定應(yīng)進(jìn)行的研究指標(biāo)（例如正確性）以及每種研究指標(biāo)應(yīng)該滿足的標(biāo)準(zhǔn)。在設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)完成之后，驗(yàn)證研究其是否滿足預(yù)定義的性能。如果檢測(cè)不符合任何預(yù)定義的性能標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)該修改并重新驗(yàn)證。通過(guò)反復(fù)的設(shè)計(jì)，開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證，直到檢測(cè)滿足設(shè)定需求。在整個(gè)過(guò)程中，申請(qǐng)人需要記錄所有研究方案，研究過(guò)程和結(jié)果，以及每項(xiàng)研究設(shè)計(jì)的理由。申請(qǐng)人應(yīng)列出檢測(cè)樣本水平相關(guān)參數(shù)，建議以列表形式明確，詳見(jiàn)附表1

申請(qǐng)人應(yīng)提供整個(gè)檢測(cè)流程SOP文件，對(duì)NGS技術(shù)檢測(cè)全過(guò)程包括的樣本收集處理、文庫(kù)制備、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告等過(guò)程進(jìn)行詳細(xì)描述。生物信息學(xué)分析方面描述和記錄數(shù)據(jù)處理和分析，包括變異識(shí)別，過(guò)濾和注釋的所有過(guò)程。明確所有要使用的軟件，包括來(lái)源（例如，內(nèi)部開(kāi)發(fā)的以及第三方的）以及任何修改。建議以列表形式描述所有需要的軟件和/或數(shù)據(jù)庫(kù)名稱及其功能。

申請(qǐng)人在計(jì)劃開(kāi)發(fā)一個(gè)有針對(duì)性的基因檢測(cè)試劑時(shí)，需確定其預(yù)期用途和待測(cè)基因數(shù)量，包括將要檢測(cè)的樣本類(lèi)型、適用人群以及哪些類(lèi)型的檢測(cè)信息將被評(píng)估和報(bào)告。還應(yīng)考慮影響檢測(cè)的設(shè)計(jì)，驗(yàn)證和質(zhì)量控制的其他因素。并在試劑組成說(shuō)明書(shū)中應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明該產(chǎn)品包含的試劑組分及需要但未提供的試劑、設(shè)備及耗材。

（二）主要原材料的研究資料

NGS檢測(cè)過(guò)程主要包括樣本收集處理、文庫(kù)制備、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告等。

1.樣本收集處理（如適用）

樣本收集處理過(guò)程是盡力做到樣本具有能如實(shí)反映患者體征的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。申請(qǐng)人需提交涉及樣本收集及處理相關(guān)試劑主要原材料信息，如樣本的運(yùn)輸保存試劑、樣本制備試劑、核酸提取試劑的主要組成成分等。

2. 文庫(kù)制備及測(cè)序

測(cè)序文庫(kù)及測(cè)序過(guò)程主要包含脫氧三磷酸核苷、接頭序列、連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、引物、探針、接頭等；如為申請(qǐng)人自行研究主要原材料，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)過(guò)程予以詳述；并提供對(duì)各主要原材料的功能性研究。并對(duì)制備完成的原料成品進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)以確認(rèn)其符合標(biāo)準(zhǔn)要求，整個(gè)生產(chǎn)工藝應(yīng)穩(wěn)定可控。如為申請(qǐng)人外購(gòu)主要原材料，應(yīng)詳述每一原材料外購(gòu)方來(lái)源，提交外購(gòu)方出具的每種原材料性能指標(biāo)及質(zhì)量控制資料，并詳述申請(qǐng)人對(duì)外購(gòu)主要原材料的各指標(biāo)質(zhì)量要求以及確定該原材料作為本產(chǎn)品主要原材料的詳細(xì)依據(jù)。核酸類(lèi)檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

3.生物信息分析及數(shù)據(jù)庫(kù)要求

NGS的數(shù)據(jù)分析流程或生物信息學(xué)流程一般可以分為四個(gè)主要操作：堿基識(shí)別，序列比對(duì)，變異識(shí)別和變異注釋。明確參考序列類(lèi)型，輔助測(cè)序比對(duì)拼接和測(cè)序結(jié)果確認(rèn)。不同突變類(lèi)型可能需要開(kāi)發(fā)不同的變異/突變檢測(cè)算法。其次，因根據(jù)產(chǎn)品設(shè)計(jì)類(lèi)型提供軟件工具的范圍和所需的驗(yàn)證類(lèi)型。建議申請(qǐng)人提交數(shù)據(jù)庫(kù)（參考序列）的溯源信息、數(shù)據(jù)庫(kù)類(lèi)型、完整性、實(shí)時(shí)性、維護(hù)以及升級(jí)方案以及分析軟件的版本、算法、性能驗(yàn)證以及升級(jí)方案等資料。

4.內(nèi)部參考品是盡力做到產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測(cè)值可溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過(guò)程、定值研究、評(píng)價(jià)指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)部陽(yáng)性/陰性參考品的來(lái)源、基因序列設(shè)置等信息進(jìn)行正確的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并提供參考品溯源過(guò)程的測(cè)量程序或參考方法的相關(guān)信息及詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

具體要求如下：

4.1陽(yáng)性參考品及陽(yáng)性質(zhì)控品：

4.1.1陽(yáng)性參考品

理想狀態(tài)下，陽(yáng)性參考品應(yīng)當(dāng)包括對(duì)所申報(bào)產(chǎn)品每個(gè)基因型的質(zhì)控樣本。但考慮到基于NGS技術(shù)的可檢測(cè)基因數(shù)量較多，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品預(yù)期用途、臨床意義及基因類(lèi)型等因素進(jìn)行針對(duì)性和代表性的設(shè)計(jì)。

陽(yáng)性參考品應(yīng)包含所有需有明確藥物治療用途的基因類(lèi)型，如對(duì)藥物使用具有明確指導(dǎo)性的位點(diǎn)的參考品設(shè)置，需至少包括不同基因類(lèi)型中代表性的基因類(lèi)型，應(yīng)采用臨床樣本或細(xì)胞系提取的DNA儲(chǔ)備液作為原料。

對(duì)于具有顯著臨床意義或潛在臨床意義的基因，因考慮代表性問(wèn)題，明確具有臨床診斷意義的基因類(lèi)型及基因型中不同的變異類(lèi)型，突變頻率、變異類(lèi)型的選取應(yīng)具有代表性，包括不同外顯子，不同基因變異突變等。如檢測(cè)目標(biāo)區(qū)較大（大于1M），需對(duì)檢測(cè)區(qū)域整體和靈敏度進(jìn)行質(zhì)控（特別是針對(duì)SNV），可以采用混合的永生化正常人白細(xì)胞DNA儲(chǔ)存液（HapMap細(xì)胞系）等。

不同突變/變異的變異豐度及突變頻率，濃度范圍設(shè)置應(yīng)具有代表性并提供這樣設(shè)定的依據(jù)。陽(yáng)性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需采用有效方法進(jìn)行確認(rèn),并明確接受標(biāo)準(zhǔn)。申請(qǐng)人在設(shè)計(jì)陽(yáng)性參考品時(shí)可一并考慮檢測(cè)限參考品的設(shè)置及確認(rèn)方式，并提供相關(guān)的依據(jù)。

4.1.2陽(yáng)性質(zhì)控品

模仿病人樣本的目標(biāo)核酸序列，并用于質(zhì)控整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，包括核酸提?。ㄈ邕m用）、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。目前陽(yáng)性質(zhì)控檢測(cè)和分析過(guò)程應(yīng)與臨床樣本方式一致。

4.2陰性參考品及陰性質(zhì)控品

陰性參考品應(yīng)為FFPE 正常樣本的混合物，陰性質(zhì)控品FFPE 正常樣本的混合物或細(xì)胞系，應(yīng)明確不含有目標(biāo)區(qū)域腫瘤突變基因以及目標(biāo)基因中的胚系突變基因。

4.3精密度參考品

精密度參考品設(shè)置要求可參考陽(yáng)性/陰性參考品。

4.4 PCR 試劑無(wú)模板參考品（NTC）

申請(qǐng)人應(yīng)建立NTC 對(duì)照Qubit 檢測(cè)接受標(biāo)準(zhǔn)。監(jiān)測(cè)檢測(cè)過(guò)程中是否存在染污。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

NGS檢測(cè)是一個(gè)復(fù)雜的工作流程，它由很多獨(dú)立步驟組合而成?；?span lang="EN-US">NGS的檢測(cè)可能包括但不限于以下步驟：樣本采集，處理和存儲(chǔ);DNA提取;DNA處理和文庫(kù)制備;序列讀取和堿基識(shí)別;序列比對(duì)，變異識(shí)別，變異注釋和過(guò)濾，變異評(píng)估和注釋，以及生成檢測(cè)報(bào)告。一般而言，對(duì)于每個(gè)檢測(cè)組成部分，申請(qǐng)人應(yīng)建立其特定檢測(cè)的指標(biāo)和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。必須對(duì)NGS每個(gè)操作流程的性能表現(xiàn)進(jìn)行一個(gè)內(nèi)部的驗(yàn)證。每步流程都需要分別優(yōu)化到一個(gè)賊佳經(jīng)驗(yàn)值，以此來(lái)綜合決定賊佳的實(shí)驗(yàn)操作條件及各參數(shù)的設(shè)置。

1.應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置等，提供確切的依據(jù)，配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求。

2.主要生產(chǎn)工藝、反應(yīng)原理介紹。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程（如涉及）及賊佳反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度等。確定的溫度和時(shí)間的研究資料。

3.申報(bào)產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸分離/純化過(guò)程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。如包括但不限于核酸體積、質(zhì)量、濃度、純度及完整性等。核酸濃度、純度檢測(cè)方法包括但不限于熒光法等；核酸完整性檢測(cè)方法包括但不限于瓊脂糖凝膠法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等。

（四）分析性能評(píng)估資料

分析性能評(píng)估是反映產(chǎn)品主要原材料選擇，生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系等多方面因素設(shè)置是否合理的客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)。檢測(cè)試劑性能的研究方案應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的反應(yīng)原理，臨床預(yù)期用途，使用條件等綜合因素進(jìn)行設(shè)計(jì)。性能研究應(yīng)涵蓋產(chǎn)品研制階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。

本部分內(nèi)容將從NGS檢驗(yàn)流程中的質(zhì)量控制要求和主要性能指標(biāo)兩部分進(jìn)行要求：

1.NGS檢驗(yàn)流程

檢測(cè)方法中，應(yīng)明確所有檢測(cè)要素（例如，儀器，軟件，消耗品，試劑）和用于檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的檢測(cè)要素。確定設(shè)計(jì)方案和標(biāo)準(zhǔn)并詳細(xì)記錄設(shè)計(jì)研究過(guò)程。對(duì)于基于NGS的檢測(cè)的每個(gè)組成，應(yīng)該確定規(guī)范并記錄。記錄每個(gè)檢測(cè)組成對(duì)于關(guān)鍵因素（例如覆蓋率，堿基質(zhì)量）的局限性。確定并記錄基因組的檢測(cè)區(qū)域，包括基因和變異類(lèi)型，如果關(guān)鍵的測(cè)序區(qū)域不符合賊低性能要求（例如賊小覆蓋標(biāo)準(zhǔn)），則應(yīng)修改檢測(cè)并重新驗(yàn)證以達(dá)到賊低性能要求。同時(shí)，應(yīng)在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)和/或標(biāo)簽中明確可能影響或限制產(chǎn)品檢測(cè)性能情形。

1.1樣本制備

申請(qǐng)人需考慮可接受檢測(cè)的樣本類(lèi)型對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，例如所需采集設(shè)備的類(lèi)型，樣本的賊小體積或數(shù)量，或采集和使用之間樣本穩(wěn)定性必須遵守的任何采集條件。每種樣本類(lèi)型及采集方式應(yīng)建立相應(yīng)的SOP，并驗(yàn)證對(duì)其整體檢測(cè)性能的影響。

在NGS檢測(cè)試劑的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)過(guò)程中，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)配套使用的核酸提取、分離、純化及富集試劑進(jìn)行驗(yàn)證并提供驗(yàn)證方案的依據(jù)，建議包括但不限于核酸質(zhì)量、濃度、純度及完整性等。核酸濃度、純度檢測(cè)方法包括但不限于熒光法等；核酸完整性檢測(cè)方法包括但不限于瓊脂糖凝膠法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等。應(yīng)明確樣品質(zhì)量（包括但不限于核酸濃度、純度及完整性）的賊低要求并進(jìn)行質(zhì)量控制。如分離/純化后的核酸儲(chǔ)備液質(zhì)量（如濃度范圍）不符合要求，應(yīng)重新取材或擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行核酸分離/純化。

1.2測(cè)序文庫(kù)制備

文庫(kù)制備是產(chǎn)生特定大小范圍的DNA或cDNA片段的過(guò)程。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)不同測(cè)序平臺(tái)的性能特點(diǎn)，對(duì)核酸序列進(jìn)行片段化處理，片段的長(zhǎng)短應(yīng)符合后續(xù)測(cè)序的要求，片段化方法包括但不限于超聲法、酶切法等。申請(qǐng)人應(yīng)制定核酸序列片段化操作流程及質(zhì)量控制方案，對(duì)經(jīng)過(guò)片段化的核酸短序列的濃度、純度及片段分布等參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

文庫(kù)制備的關(guān)鍵步驟是在DNA片段的兩端連接測(cè)序接頭，接頭序列是一段人為設(shè)計(jì)的序列，包含用于測(cè)序過(guò)程的多個(gè)目的的多個(gè)序列組分。如啟動(dòng)測(cè)序反應(yīng)的通用測(cè)序引物序列，用于PCR擴(kuò)增引物序列，錨定序列，索引（條形碼）序列。如申請(qǐng)人采用自定義序列，應(yīng)提供設(shè)計(jì)依據(jù)及研究資料。加接頭可以是獨(dú)立的步驟，也可以在靶向序列富集過(guò)程中添加。申請(qǐng)人使用條碼或標(biāo)簽時(shí)，需充分驗(yàn)證并滿足測(cè)序所需的質(zhì)量要求，如測(cè)序深度、覆蓋度等條件。同時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)潛在的問(wèn)題進(jìn)行充分研究，包括但不限于：條碼檢出率的均勻性、條碼互換比率以及條碼間相互污染或干擾等因素。申請(qǐng)人應(yīng)報(bào)告有效的條碼或標(biāo)簽數(shù)量，并對(duì)每個(gè)條碼或標(biāo)簽的序列及其位置有詳細(xì)、清晰的記錄。

1.3測(cè)序及堿基讀取

目前可用的測(cè)序平臺(tái)具有不同的測(cè)序方法，包括聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法、合成測(cè)序和離子半導(dǎo)體測(cè)序，以及不同的檢測(cè)方法。盡管技術(shù)性能相似，平臺(tái)之間也存在差異，特別是不同的DNA輸入量要求，不同的試劑成本，運(yùn)行時(shí)間，讀數(shù)長(zhǎng)度和每個(gè)樣本的成本。這些差異會(huì)影響儀器處理低質(zhì)量樣本的能力，檢測(cè)插入/缺失的能力以及樣本通量。

申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)所選用的測(cè)序平臺(tái)，選擇合適的參數(shù)指標(biāo)對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，制定相應(yīng)的管理制度及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并明確失控情況下的糾正措施。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)具體應(yīng)用情況，如測(cè)序區(qū)域的大小及序列特征等因素確定測(cè)序所需要的覆蓋度及深度。在測(cè)序過(guò)程中，申請(qǐng)人應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案監(jiān)控整個(gè)測(cè)序過(guò)程當(dāng)中的測(cè)序質(zhì)量。

申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)具體的預(yù)期用途，制定產(chǎn)品的測(cè)序總體數(shù)據(jù)量、覆蓋度（read數(shù)）和深度要求，并提供充分的理論依據(jù)及驗(yàn)證結(jié)果。申請(qǐng)人應(yīng)描述清晰，例如，在確立測(cè)序深度時(shí)需要明確指出是平均測(cè)序深度還是賊低測(cè)序深度；還需要說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)類(lèi)型，如原始測(cè)序數(shù)據(jù)（原始read數(shù)）、過(guò)濾之后的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)、去除重復(fù)之后的數(shù)據(jù)計(jì)算測(cè)序深度。

堿基識(shí)別是指識(shí)別一段基因序列片段每一個(gè)位點(diǎn)的核苷酸的過(guò)程。不同測(cè)序平臺(tái)具有不同的測(cè)序偏好性，可影響堿基讀取過(guò)程中的錯(cuò)誤類(lèi)型與比率。應(yīng)用軟件可以消除或部分抵消測(cè)序偏好性的影響，提高堿基讀取的正確性。堿基讀取后，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)每個(gè)堿基讀取的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。若堿基讀取質(zhì)量有通用標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)遵循并引用；若沒(méi)有通用標(biāo)準(zhǔn)，可根據(jù)具體應(yīng)用情況制定堿基讀取質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及分析方法，并提供充分的理論依據(jù)及驗(yàn)證結(jié)果。

1.4生物信息學(xué)分析

申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)生物信息學(xué)分析流程有完整的記錄，建立完善的生物信息學(xué)分析軟件的版本控制方案。申請(qǐng)人應(yīng)建立生物信息學(xué)分析標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案，盡力做到測(cè)序數(shù)據(jù)的分析、解讀及報(bào)告的正確性與嚴(yán)謹(jǐn)性。生物信息學(xué)分析流程應(yīng)描述清晰，包括每一步驟使用軟件的名稱、版本、參數(shù)設(shè)置要求，包括但不限以下指標(biāo)：說(shuō)明檢查每個(gè)讀段和每個(gè)堿基的Q值，堿基的頻率分布，讀長(zhǎng)分布及是否存在重復(fù)序列和人工序列的評(píng)價(jià)方法，以盡力做到按照該流程生物信息學(xué)分析結(jié)果可復(fù)現(xiàn)。生物信息學(xué)分析應(yīng)至少報(bào)告具有明確臨床指導(dǎo)意義的結(jié)果。

生物信息學(xué)分析一般包括但不限于堿基識(shí)別，堿基對(duì)比，變異識(shí)別和變異注釋。根據(jù)測(cè)序類(lèi)型和檢測(cè)報(bào)告的變異類(lèi)型選擇生物信息流程，并考慮變異識(shí)別和評(píng)估流程過(guò)程中的限制因素以及第三方生物信息學(xué)工具對(duì)整個(gè)生物信息流程的影響。

1.4.1數(shù)據(jù)追蹤和記錄：軟件應(yīng)自動(dòng)對(duì)樣本跟蹤以及記錄每個(gè)測(cè)序Run 相關(guān)多種數(shù)據(jù)信息（如：索引（條形碼），測(cè)序run 記錄，樣本登記號(hào)，患者病例號(hào)，樣本來(lái)源，樣本類(lèi)型，以及測(cè)試版本等）

在數(shù)據(jù)分析不同階段進(jìn)行樣本狀態(tài)跟蹤；對(duì)指定樣本進(jìn)行反復(fù)分析跟蹤；記錄分析中使用的算法以及數(shù)據(jù)庫(kù)版本信息；選擇的流程輸出的文件（如：FASTQ,BAM,VCF等）以及測(cè)序Run 相關(guān)統(tǒng)計(jì)參數(shù)（如，簇密度，簇通過(guò)過(guò)濾條件比例，未分配序列索引等）。

1.4.2堿基識(shí)別

隨著測(cè)序循環(huán)數(shù)的增加，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量可能因測(cè)序系統(tǒng)噪音等問(wèn)題出現(xiàn)下降，申請(qǐng)人需提供堿基識(shí)別的軟件資料，包括分析軟件可以滿足申報(bào)產(chǎn)品預(yù)期用途的研究資料，質(zhì)量閾值設(shè)置依據(jù)。根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品可檢測(cè)的基因類(lèi)型，申請(qǐng)人應(yīng)確認(rèn)軟件工具的范圍和所需的驗(yàn)證類(lèi)型。并提供不同的計(jì)算方法研究資料。申請(qǐng)人應(yīng)說(shuō)明分析流程使用的軟件類(lèi)型。FASTQ 文件生成過(guò)程。明確去重質(zhì)控參數(shù)，如每個(gè)堿基測(cè)序質(zhì)量質(zhì)控參數(shù)，序列內(nèi)容，GC 含量以及序列長(zhǎng)度分布，未匹配索引的相比對(duì)比例。

明確測(cè)序讀數(shù)的基準(zhǔn)質(zhì)量得分（例如Q得分）的閾值。明確中等基準(zhǔn)質(zhì)量和基準(zhǔn)百分比高于預(yù)定質(zhì)量閾值的標(biāo)準(zhǔn)。明確修剪堿基百分比的閾值（如適用）。如采用其他方法，應(yīng)提供研究資料及選擇依據(jù)。

1.4.3基因組對(duì)比以及BAM 生成

申請(qǐng)人應(yīng)提供適用于檢測(cè)的過(guò)濾規(guī)則，明確過(guò)濾閾值及過(guò)濾目的和方式。例如，覆蓋深度（DP）、突變序列數(shù)量（AD）頻數(shù)均一化覆蓋深度和變異頻率（VF）、假的接頭序列、去除PCR重復(fù)片段、消除低等位基因頻率的變體、使用數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)幫助注釋和過(guò)濾的難以檢測(cè)序列區(qū)域、驗(yàn)證特定的檢測(cè)群體是否包含在數(shù)據(jù)集中，并記錄數(shù)據(jù)庫(kù)版本號(hào)。

申請(qǐng)人應(yīng)提供參考序列的選擇依據(jù)，本指導(dǎo)原則不適用于從頭測(cè)序法，如為特殊序列，應(yīng)提供采用該序列的依據(jù)并明確適用測(cè)序平臺(tái)的關(guān)鍵序列信息。比對(duì)的序列被寫(xiě)入序列比對(duì)圖（SAM）文件，接著轉(zhuǎn)換成二進(jìn)制比對(duì)圖（BAM）格式。

1.4.4突變基因分析：分析流程識(shí)別不同突變類(lèi)型，通過(guò)過(guò)濾去除低質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)。

1.4.5突變注釋：申請(qǐng)人應(yīng)提供每個(gè)突變預(yù)測(cè)的功能性作用以及臨床解釋注釋的形成過(guò)程及數(shù)據(jù)來(lái)源依據(jù)。

1.5 NGS數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)、傳輸與共享

用于儲(chǔ)存原始和經(jīng)過(guò)分析后的檢測(cè)結(jié)果。建議申請(qǐng)人提交數(shù)據(jù)存儲(chǔ)中心的安全性、穩(wěn)定性、維護(hù)與升級(jí)方案以及異常情況處置方案等資料。

1.6 公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用（如適用）

如申報(bào)產(chǎn)品的測(cè)序結(jié)果需要借助公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)果注釋或報(bào)告解讀，申請(qǐng)人需提供所使用的公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)在產(chǎn)品檢測(cè)中起到的作用說(shuō)明，公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)類(lèi)型，功能介紹，標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案等。

2.主要性能指標(biāo)

分析性能驗(yàn)證包括通過(guò)一組預(yù)定義性能評(píng)價(jià)方式，以證明性能是否足以滿足其預(yù)期用途并符合預(yù)定義的性能標(biāo)準(zhǔn)。通常涉及是否符合統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)要求，或檢測(cè)是否存在關(guān)于患者的疾病或其他病癥信息的變異等。

2.1分析性能用樣本設(shè)置要求

申請(qǐng)人應(yīng)提供用于評(píng)估各項(xiàng)性能研究的標(biāo)本數(shù)量和類(lèi)型設(shè)定的依據(jù)。根據(jù)產(chǎn)品預(yù)期用途，樣本研究應(yīng)包括代表性變異和變異類(lèi)型。研究應(yīng)考慮與檢測(cè)適應(yīng)癥相關(guān)的臨床意義區(qū)域，跨不同基因組的變異、基因組難以測(cè)序或難以比對(duì)的區(qū)域，人工混合嵌合體以及任何其他變體類(lèi)型，區(qū)域或區(qū)域上下限。例如：如果檢測(cè)旨在用于檢測(cè)和報(bào)告indel，則應(yīng)包括以適當(dāng)大小的基因片段包括變異的分布，插入和缺失。

應(yīng)在研究中使用含有與檢測(cè)適應(yīng)癥相關(guān)的臨床相關(guān)變異的臨床樣本，并應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)拇硇砸员M力做到聲稱可通過(guò)檢測(cè)和報(bào)告的臨床相關(guān)序列變異和基因組情況。應(yīng)盡可能使用含有特定臨床相關(guān)變體的前瞻性臨床樣本。在一些有限的情況下，當(dāng)臨床樣本，細(xì)胞系或生物合成材料不可用時(shí)或當(dāng)真實(shí)樣本無(wú)法有效覆蓋生物分析流程時(shí)，除生物學(xué)樣本之外，可以使用含有各種要求類(lèi)型的已知序列變體（例如，SNV，插入，結(jié)構(gòu)變異，CNV等）的計(jì)算機(jī)構(gòu)建的序列標(biāo)本來(lái)評(píng)估生物分析流程的性能。申請(qǐng)人可采用分析軟件如BAMSurgeon等，編輯滿足驗(yàn)證需要的模擬樣本或數(shù)學(xué)模型，對(duì)生物分析流程進(jìn)行驗(yàn)證。但是，這些數(shù)據(jù)文件應(yīng)該使用與申報(bào)產(chǎn)品相同的預(yù)分析和分析方法來(lái)生成。應(yīng)提供每個(gè)序列樣本中的堿基相關(guān)的堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以體現(xiàn)在堿基調(diào)取中錯(cuò)誤發(fā)生的可能性。

2.2正確性

2.2.1總體要求

正確性包括對(duì)比檢測(cè)值與被檢測(cè)值之間一致性。對(duì)于基于NGS測(cè)序原理的檢測(cè)，通過(guò)與適當(dāng)?shù)膶?duì)比方法比較，如雙向測(cè)序或其他經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法，評(píng)估申報(bào)產(chǎn)品正確性能。

根據(jù)檢測(cè)的性能指標(biāo)，正確性研究應(yīng)包括代表性變異和變異類(lèi)型。研究應(yīng)考慮與檢測(cè)適應(yīng)癥相關(guān)的臨床意義區(qū)域、突變頻率、跨不同基因片段的變異、基因組難以測(cè)序或難以辨識(shí)的區(qū)域、嵌合體以及任何其他變異類(lèi)型、區(qū)域或被測(cè)區(qū)域上下限等。

對(duì)于每種變異類(lèi)型以及代表性臨床相關(guān)變異，加入突變頻率考慮，均應(yīng)計(jì)算正確度。對(duì)于變異類(lèi)型，為了確定檢測(cè)的變異類(lèi)型以及檢測(cè)它們的測(cè)序區(qū)域（不管變異是否具有致病性），可以使用具有代表性的參考物質(zhì)或具有高置信度的樣本進(jìn)行研究。對(duì)于臨床相關(guān)的變異，正確性計(jì)算包含使用基于臨床樣本的研究數(shù)據(jù)與臨床樣本相關(guān)的指標(biāo)。

正確性研究中應(yīng)含有臨床相關(guān)變異與檢測(cè)適應(yīng)癥的臨床樣本，以盡力做到臨床相關(guān)序列變異被檢測(cè)和報(bào)告。正確性評(píng)估如采用前瞻性臨床樣本時(shí)，收集和處理的方式應(yīng)與產(chǎn)品預(yù)期用途一致。如果前瞻性的臨床樣本不可用，則可以使用臨床相關(guān)區(qū)域中含有特定變異的凍存臨床樣本或人類(lèi)細(xì)胞系樣本替代或補(bǔ)充研究。

通過(guò)陽(yáng)性符合率（PPA），陰性符合率（NPA）證明試劑正確性。為PPA，NPA設(shè)置評(píng)價(jià)指標(biāo)，以盡力做到檢測(cè)滿足其預(yù)定義的性能范圍。通過(guò)檢測(cè)評(píng)估的每種類(lèi)型的變異（如，SNV，插入，結(jié)構(gòu)變異）和測(cè)序區(qū)域范圍（如高度同源，高度多態(tài)或其他困難的區(qū)域）分別計(jì)算PPA，NPA。

表1正確性評(píng)估方法

		對(duì)比方法		總數(shù)
		陽(yáng)性	陰性
檢測(cè)項(xiàng)目	陽(yáng)性	A	B	A+B
	陰性	C	D	C+D
	總數(shù)	A+C	B+D	A+B+C+D

表1注：PPA通過(guò)將A（真陰性結(jié)果數(shù)）除以（A + C）。NPA通過(guò)將D（真陰性結(jié)果數(shù)）除以（D + B）。這些計(jì)算不應(yīng)包含任何無(wú)應(yīng)答或無(wú)效答應(yīng)，無(wú)應(yīng)答或無(wú)效答應(yīng)結(jié)果應(yīng)被單獨(dú)列出（見(jiàn)表2）。根據(jù)適用情況計(jì)算每種變體類(lèi)型以及臨床相關(guān)變體PPA、NPA。

表2正確性評(píng)估方法

		對(duì)比方法		總數(shù)
		陽(yáng)性	陰性
檢測(cè)項(xiàng)目	陽(yáng)性	A	B	A+B
	陰性	C	D	C+D
	無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答	E	F	E+F
	總數(shù)	A+C+E	B+D+F	N

表2注：正確性研究中無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答的百分比應(yīng)該被估計(jì)為（E + F）/ N以及95％的雙側(cè)置信區(qū)間。此外，應(yīng)評(píng)價(jià)陰性結(jié)果中的無(wú)呼叫或無(wú)效呼叫E /（A + C + E）和陽(yáng)性結(jié)果中的無(wú)呼叫或無(wú)效呼叫F /（B + D + F）。申請(qǐng)人應(yīng)設(shè)定無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答的賊小可接受標(biāo)準(zhǔn)并提供依據(jù)。樣本總數(shù)（N = A + B + C + D + E + F）。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)沒(méi)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答產(chǎn)生原因進(jìn)行分析，注意區(qū)分無(wú)呼叫或無(wú)效結(jié)果與模棱兩可結(jié)果，如質(zhì)控正常但結(jié)果無(wú)法識(shí)別的情況等。

2.2.2參考品正確性

各水平、各突變位點(diǎn)的陽(yáng)性參考品均應(yīng)按要求檢出陽(yáng)性，考慮到濃度梯度的不同，應(yīng)對(duì)各水平陽(yáng)性參考品設(shè)置相應(yīng)檢出要求；陰性參考品在各個(gè)引物探針組合的檢測(cè)條件下均應(yīng)檢出為陰性。

2.3檢測(cè)限

明確可接受的賊低檢測(cè)限，并明確無(wú)效檢測(cè)或無(wú)應(yīng)答檢測(cè)結(jié)果可接受標(biāo)準(zhǔn)。為預(yù)期用途中包含的每種變異類(lèi)型建立LoD。如果檢測(cè)人工混合的樣本（如嵌合樣本），需要考慮不同的等位基因比率，確定檢測(cè)限。

試劑LOD的研究中應(yīng)在不同的常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室條件和確定的樣本類(lèi)型下進(jìn)行。通常，LOD值被確立為具有至少95％的陽(yáng)性檢出率和可接受水平的無(wú)效的或未檢測(cè)到的檢測(cè)水平。當(dāng)不同的變異類(lèi)型可能具有不同的LoD時(shí)，需要計(jì)算不同的序列被測(cè)區(qū)域范圍中的每個(gè)變異類(lèi)型的LoD。NGS檢測(cè)方法可以同時(shí)檢測(cè)多種類(lèi)型突變基因，因此靈敏度的設(shè)置應(yīng)根據(jù)不同突變基因類(lèi)型及判讀方式進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4空白限（檢測(cè)基線）

應(yīng)確認(rèn)不會(huì)對(duì)報(bào)告區(qū)域的質(zhì)量分?jǐn)?shù)或覆蓋率產(chǎn)生負(fù)面影響。應(yīng)包含具有代表性的基因組區(qū)域，變異類(lèi)型和序列背景進(jìn)行驗(yàn)證研究。設(shè)置空白檢測(cè)限檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定評(píng)價(jià)方案及方法。

沒(méi)有探針采集的區(qū)域可以整理并列表展示。采用已知特定區(qū)域無(wú)突變（變異）的陰性參考品進(jìn)行重復(fù)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性時(shí)背景噪音。生信對(duì)于空白限，需給出有效深度的下限。當(dāng)數(shù)據(jù)低于這個(gè)值時(shí)，視為該位點(diǎn)數(shù)據(jù)為噪音。

2.5分析特異性

分析特異性是評(píng)估產(chǎn)品僅可檢測(cè)到預(yù)期待測(cè)變異的能力。根據(jù)預(yù)期用途和產(chǎn)品設(shè)計(jì)，一些潛在的內(nèi)源性或外源性物質(zhì)干擾和交叉反應(yīng)或交叉污染可能會(huì)對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)性能產(chǎn)生影響。

交叉反應(yīng)（如同源區(qū)域，假基因和其他類(lèi)型的交叉反應(yīng)序列）可能導(dǎo)致錯(cuò)誤檢測(cè)，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果?；颊邩?biāo)本的交叉污染可能將其他不正常的序列引入到檢測(cè)中，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。因此，應(yīng)選擇產(chǎn)品預(yù)期用途所覆蓋樣本或樣本類(lèi)型以及DNA提取方法中相關(guān)的干擾物質(zhì)開(kāi)展研究。同時(shí)，應(yīng)對(duì)已知交叉反應(yīng)的等位基因和同源區(qū)域進(jìn)行評(píng)估。此外，需要評(píng)估患者樣本之間的攜帶或交叉污染。

2.6精密度

精密度研究主要是指使用相同的樣本（包括檢測(cè)臨界值附近的樣本）在各種特定條件下進(jìn)行檢測(cè)（如不同操作員，不同操作條件，不同檢測(cè)天數(shù)，不同儀器等），并考慮了檢測(cè)中主要的變異來(lái)源。申請(qǐng)人應(yīng)評(píng)估變異和野生型基因的精密度，其中應(yīng)分別報(bào)告不同檢測(cè)區(qū)域和變異類(lèi)型的檢測(cè)值。申請(qǐng)人應(yīng)使用客觀證據(jù)和有效的統(tǒng)計(jì)方法來(lái)驗(yàn)證這些指標(biāo)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果多樣性的主要因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括但不限于檢測(cè)多個(gè)樣本，不同檢測(cè)批間、不同適用機(jī)型、試劑批次、檢測(cè)天數(shù)和操作員。

此外，申請(qǐng)人應(yīng)考慮外部因素相同的情況下，應(yīng)進(jìn)行申報(bào)試劑在相同或相似被測(cè)物的重復(fù)性檢測(cè)以評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果的變異程度。申請(qǐng)人需對(duì)每個(gè)檢測(cè)條件和檢測(cè)區(qū)域下每個(gè)變異類(lèi)型精密度分別進(jìn)行報(bào)告，還應(yīng)報(bào)告沒(méi)有應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答的百分比。

2.7體細(xì)胞與胚系突變鑒別研究(如適用)

在對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí)對(duì)該患者正常配對(duì)樣本（正常癌旁組織或外周血白細(xì)胞）進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)配對(duì)樣本與癌組織樣本中鑒定出的突變信息進(jìn)行鑒別篩選；在患者正常組織無(wú)法獲得的情況下，或者配對(duì)的正常對(duì)照測(cè)序覆蓋度低于質(zhì)控要求時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)建立一個(gè)混合的FFPE的核酸 正常對(duì)照用來(lái)進(jìn)行突變比較分析；應(yīng)確認(rèn)樣本中特有的基因多態(tài)性，并明確混合后的每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的預(yù)期頻率。

申請(qǐng)人是否使用配對(duì)樣本對(duì)體細(xì)胞突變和胚系突變進(jìn)行鑒別，但都應(yīng)遵循盡力做到正確檢測(cè)的原則。僅對(duì)癌癥組織進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)無(wú)配對(duì)樣本時(shí)，需實(shí)驗(yàn)室建立一系列的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)對(duì)體細(xì)胞突變和胚系突變進(jìn)行鑒別。建立主要過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)和利用現(xiàn)有的人群數(shù)據(jù)庫(kù)（dbSNP，1000G，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部自建等）已標(biāo)注的胚系突變信息進(jìn)行過(guò)濾，但需要注意的是這些數(shù)據(jù)庫(kù)所包含的胚系突變信息可能不全或者有錯(cuò)誤之處。因此在無(wú)配對(duì)樣本時(shí)，實(shí)驗(yàn)室需要對(duì)建立的鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證，盡力做到正確鑒別體細(xì)胞突變和胚系突變。

2.8批次互通性（如適用）

NGS的檢測(cè)通常包括試劑，消耗品，儀器和軟件。各部分相對(duì)獨(dú)立，申請(qǐng)人需對(duì)各批次之間是否互通進(jìn)行研究。

2.9軟件研究（如適用）

根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品預(yù)期用途，可能存在一些軟件產(chǎn)品不包含在申報(bào)產(chǎn)品組成成分中，但生物信息分析過(guò)程中需要用到該軟件，則該軟件被視為檢測(cè)系統(tǒng)一部分，申請(qǐng)人應(yīng)提供該部分軟件相關(guān)適用性研究資料。

2.10其他

評(píng)估檢測(cè)局限性時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)采用特殊樣本，如大于特定大小的插入或缺失或重排，并確定檢測(cè)無(wú)法以預(yù)期的正確度和正確度檢測(cè)到的序列變化類(lèi)型。如果這些區(qū)域是申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)預(yù)期用途的一部分，則需要驗(yàn)證高度同源，高度多態(tài)或其他困難區(qū)域的變異的檢測(cè)性能。如果被檢測(cè)的基因組區(qū)域的一部分難以測(cè)序并且不能達(dá)到性能閾值，則應(yīng)該將其報(bào)告為檢測(cè)局限性。如適用，申請(qǐng)人應(yīng)記錄申報(bào)產(chǎn)品不會(huì)報(bào)告的檢測(cè)類(lèi)型。

在設(shè)計(jì)和驗(yàn)證過(guò)程中，申請(qǐng)人應(yīng)記錄所有檢測(cè)失敗情況并分析原因。例如，由于未能滿足其一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)運(yùn)行質(zhì)量指標(biāo)等。不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)區(qū)域不應(yīng)報(bào)告變異陽(yáng)性結(jié)果。由于未能達(dá)到檢測(cè)運(yùn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)而未受到檢測(cè)的區(qū)域，則應(yīng)如實(shí)報(bào)告。

申報(bào)產(chǎn)品上市后，通過(guò)上市后數(shù)據(jù)收集和分析或藥物標(biāo)簽中說(shuō)明明確具有伴隨診斷用途的基因，在不改變?cè)蟹磻?yīng)體系和檢測(cè)方式等情況，申請(qǐng)人可通過(guò)申請(qǐng)變更其臨床用途。

附表1

            參數(shù)描述列表

參數(shù)	描述/接受標(biāo)準(zhǔn)
檢測(cè)基因數(shù)	描述
檢測(cè)堿基數(shù)（bp）	描述
原始read數(shù)	評(píng)估測(cè)序量
原始測(cè)序深度	評(píng)估測(cè)序量
有效測(cè)序深度（如經(jīng)過(guò)去重處理等）	評(píng)估有效的測(cè)序量及測(cè)序深度
有效深度的均一性：	評(píng)估建庫(kù)/測(cè)序的質(zhì)量
賊低測(cè)序深度閾值（×）	評(píng)估有效的測(cè)序量及測(cè)序深度
平均測(cè)序深度閾值（×）	評(píng)估有效的測(cè)序量及測(cè)序深度
符合賊低測(cè)序深度和平均測(cè)序深度要求的區(qū)域（%）	評(píng)估有效的測(cè)序量及測(cè)序深度
測(cè)序深度均值±標(biāo)準(zhǔn)差（×）	評(píng)估有效的測(cè)序量及測(cè)序深度
賊低測(cè)序深度的均值±標(biāo)準(zhǔn)差（×）	評(píng)估有效的測(cè)序量及測(cè)序深度
總重復(fù)率（duplication ratio）	評(píng)估建庫(kù)/測(cè)序的質(zhì)量
目標(biāo)區(qū)內(nèi)的重復(fù)率（duplicate reads）	評(píng)估建庫(kù)/測(cè)序的質(zhì)量
目標(biāo)區(qū)內(nèi)的捕獲率（on target ratio）	評(píng)估探針/建庫(kù)/測(cè)序的質(zhì)量
脫靶率（off target ratio）	評(píng)估探針/建庫(kù)/測(cè)序的質(zhì)量
GC含量（GC content）	評(píng)估測(cè)序反應(yīng)效率和覆蓋均一性
堿基識(shí)別質(zhì)量值（base call quality scores）	Q30的概念
比對(duì)質(zhì)量值（mapping quality）	read正確比對(duì)到基因組位置的可能性
插入片段長(zhǎng)度（insert size）	評(píng)估DNA質(zhì)量與建庫(kù)質(zhì)量
其他（如適用）

注：檢測(cè)基因數(shù): 產(chǎn)品能夠檢測(cè)的基因個(gè)數(shù)。

檢測(cè)堿基數(shù)（bp）: 產(chǎn)品能夠覆蓋的總區(qū)域范圍，以堿基個(gè)數(shù)為單位。

原始read數(shù): 測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)總read數(shù)。

原始測(cè)序深度: 未去除PCR重復(fù)等的平均深度。

有效測(cè)序深度（如經(jīng)過(guò)去重處理等）: 去除PCR重復(fù)等后的平均深度。

有效深度的均一性: 大于預(yù)設(shè)定的有效測(cè)序深度閾值的覆蓋度。

賊低測(cè)序深度閾值（×）: 滿足后續(xù)分析要求的各區(qū)域內(nèi)的賊低位點(diǎn)深度。

平均測(cè)序深度閾值（×）: 滿足后續(xù)分析要求的全區(qū)域內(nèi)的賊低平均深度。

符合賊低測(cè)序深度和平均測(cè)序深度要求的區(qū)域（%）: 賊低測(cè)序深度和平均測(cè)序深度均大于閾值的區(qū)域數(shù)與區(qū)域總數(shù)的比值。

測(cè)序深度均值±標(biāo)準(zhǔn)差（×）:測(cè)序深度均值±標(biāo)準(zhǔn)差指某一批次所有檢測(cè)樣本的測(cè)序深度均值±標(biāo)準(zhǔn)差；

賊低測(cè)序深度的均值±標(biāo)準(zhǔn)差（×）: 指某一批次所有檢測(cè)樣本的賊低測(cè)序深度的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

總重復(fù)率（duplication ratio）: 重復(fù)read數(shù)與原始read數(shù)的比值。

目標(biāo)區(qū)內(nèi)的重復(fù)率（duplicate reads）: 目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的重復(fù)read數(shù)與總目標(biāo)區(qū)域read數(shù)的比值。

目標(biāo)區(qū)內(nèi)的捕獲率（on target ratio）: 目標(biāo)區(qū)域的read數(shù)與原始read數(shù)的比值。

脫靶率（off target ratio）: 非目標(biāo)區(qū)域的read數(shù)與原始read數(shù)的比值。

GC含量（GC content）: 在測(cè)序所得的所有堿基中，GC兩種堿基數(shù)與所有堿基數(shù)的比值

堿基識(shí)別質(zhì)量值（base call quality scores）: 堿基質(zhì)量值是衡量測(cè)序質(zhì)量的重要指標(biāo)，質(zhì)量值（Q）越高代表堿基被測(cè)錯(cuò)的概率（P）越小，其計(jì)算公式為Q=-10 logP；質(zhì)量值是Q30，則錯(cuò)誤識(shí)別的概率是0.1%，即錯(cuò)誤率0.1%，或者正確率是99.9%。

比對(duì)質(zhì)量值（mapping quality）: read比對(duì)到參考序列上這個(gè)位置的高效程度，用錯(cuò)誤比對(duì)到該位置的概率值來(lái)描述，MAPQ=-10 logP。

插入片段長(zhǎng)度（insert size）: 通過(guò)檢測(cè)雙端序列在基因組上的起止位置，可以得到插入片段的實(shí)際長(zhǎng)度，決定了測(cè)序的長(zhǎng)度，是信息分析的重要參數(shù)。

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