【佳學(xué)基因檢測(cè)】多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析

為了研究 lrWGS 是否可用于識(shí)別多發(fā)性骨髓瘤中的反復(fù)和私人遺傳畸變，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析對(duì)一組 37 個(gè)多發(fā)性骨髓瘤樣本進(jìn)行了 lrWGS。采集所有骨髓樣本用于診斷目的（診斷時(shí) 37 例中的 35 例），并采用擴(kuò)展的 FISH 檢測(cè)包進(jìn)行分析。為確保對(duì)純的細(xì)胞亞群進(jìn)行分析，所有使用的細(xì)胞都進(jìn)行了 FACS（圖 1A). 此外，通過(guò)主要對(duì) T 細(xì)胞執(zhí)行 lrWGS，在 37 個(gè)病例中的 32 個(gè)病例中生成了種系對(duì)照。準(zhǔn)備好的 lrWGS 文庫(kù)在多發(fā)性骨髓瘤樣本中測(cè)序深度為 31.2× 和 胚系對(duì)照樣本測(cè)序深度平均為31.6× 的平均深度。

圖1：lrWGS 可以直接在從診斷骨髓 (BM) 樣本中接受 FACS 的變性細(xì)胞上進(jìn)行。(A) 實(shí)驗(yàn)過(guò)程的示意圖概述。為了進(jìn)行遺傳、轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)表征，對(duì)來(lái)自患者骨髓樣本的多發(fā)性骨髓瘤和正常細(xì)胞（T 細(xì)胞 [T] 或粒系細(xì)胞 [My]）進(jìn)行 FACS。lrWGS 文庫(kù)直接在變性細(xì)胞上制備，無(wú)需事先進(jìn)行 DNA 純化。(BD) 散點(diǎn)圖 (B) 和箱線圖 (CD) 顯示了使用指定的細(xì)胞類型和方法制備的 lrWGS 文庫(kù)的 N50 相塊大小和平均 DNA 分子長(zhǎng)度。顯示了從 10X 平臺(tái)上制備的 DNA（HMW 或柱純化）生成的已發(fā)布 lrWGS 的質(zhì)量控制數(shù)據(jù)以供比較。

可以從少量變性細(xì)胞制備高質(zhì)量的 lrWGS 文庫(kù)

要充分利用 lrWGS 技術(shù)，必須從純化的 HMW DNA 中生成文庫(kù)。為了避免 HMW 制備的需要，佳學(xué)基因開(kāi)發(fā)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案，用于直接在用氫氧化鈉變性的細(xì)胞上制備 lrWGS 文庫(kù)。這使佳學(xué)基因能夠在 Chromium Genome 平臺(tái)上對(duì) 200 至 240 個(gè)接受 FACS（包含 ~1.2 ng DNA）的細(xì)胞制備 lrWGS 文庫(kù)。佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)，這個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方案允許維持非常大的 DNA 分子（中位 DNA 片段長(zhǎng)度，216 kbp），這直接反映在重建相塊的大小（中位 N50，14.8 Mbp；中位賊長(zhǎng)相塊，60.2 Mbp ;圖 1B-D)。賊長(zhǎng)的組裝相位塊為 120.9 Mbp，幾乎相當(dāng)于 4 號(hào)染色體的整個(gè) q 臂（138.4 Mbp 中的 120.9）。因此，該相塊幾乎達(dá)到了在不穿過(guò)著絲粒區(qū)域的情況下可實(shí)現(xiàn)的理論賊大長(zhǎng)度。正如預(yù)期的那樣，多發(fā)性骨髓瘤樣本通常在雜合性缺失的區(qū)域顯示出較差的定相，但總體而言，多發(fā)性骨髓瘤 樣本的 N50 相位塊大小與正常對(duì)照相當(dāng)（圖 1B-C)。 將佳學(xué)基因的 lrWGS 數(shù)據(jù)與從 10X 平臺(tái)上純化的 HMW DNA 生成的高質(zhì)量數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較，佳學(xué)基因的文庫(kù)是從明顯更長(zhǎng)的 DNA 分子生成的，并保持相似的相塊大小（圖 1B-D).

總的來(lái)說(shuō)，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析得出結(jié)論，直接在變性細(xì)胞上進(jìn)行 lrWGS 文庫(kù)制備可保持 DNA 完整性，并允許從數(shù)量非常有限的接受 FACS 的細(xì)胞中生成高質(zhì)量的 lrWGS。

lrWGS 和 FISH 鑒定的 CNV 高度一致

CNV 是多發(fā)性骨髓瘤的一個(gè)共同特征，用來(lái)區(qū)分HRD 亞組和高危患者。為識(shí)別 CNV，我們計(jì)算了拷貝數(shù)，生成了CNV數(shù)據(jù)。比較從 lrWGS 數(shù)據(jù)計(jì)算的染色體數(shù)據(jù)與從 FISH 計(jì)算的染色體數(shù)據(jù)，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在 37 個(gè)多發(fā)性骨髓瘤中的 35 個(gè)（95%）中正確預(yù)測(cè)了染色體數(shù)目。未正確計(jì)算拷貝數(shù)的 2 個(gè)案例顯示了廣泛而復(fù)雜的亞克隆拷貝數(shù)變化。沒(méi)有 CNV 調(diào)用程序（包括 FindSV、CNVkit、 ASCAT、和 Battenberg 方法) 正確地預(yù)測(cè)了這 2 個(gè)樣本中的染色體數(shù)。盡管如此，根據(jù) 4 號(hào)染色體覆蓋率（FISH 分析中少有已知具有正?？截悢?shù)的染色體）校正拷貝數(shù)，可以目視識(shí)別 FISH 發(fā)現(xiàn)的所有（12 條中的 12 條）CNV（圖 2A). 在 lrWGS 正確預(yù)測(cè)染色體數(shù)目的 35 名患者中，F(xiàn)ISH 鑒定的所有 CNV 的 96%（149 名中的 143 名），包括所有 1q 擴(kuò)增，在 lrWGS 數(shù)據(jù)中得到了一致性的結(jié)果（圖 2A-B). 這些結(jié)果與以前旨在比較 FISH 與傳統(tǒng) WGS 以鑒定 CNV 的研究結(jié)果相似。

圖 2：lrWGS 允許高效地檢測(cè) CNV 和識(shí)別雙重打擊多發(fā)性骨髓瘤。(A) 熱圖顯示根據(jù) lrWGS 覆蓋范圍計(jì)算的體細(xì)胞染色體 (chr1-22) 的拷貝數(shù)?？截悢?shù)在兩種情況下（由 * 表示）更正為 chr4 拷貝數(shù)（補(bǔ)充方法）。垂直黑線表示 FISH 探針的基因組定位。FISH 研究的區(qū)域用黑點(diǎn)表示，點(diǎn)在灰線上方或下方的位置分別表示拷貝數(shù)增加或減少。(B) 維恩圖顯示 FISH 調(diào)用的 CNV 和 FISH 面板中包含的區(qū)域（不包括 IGH 區(qū)域）中的 lrWGS 調(diào)用的 CNV 之間的重疊。FISH 調(diào)查的區(qū)域顯示在面板 A 中。(C) TP53 基因座周圍區(qū)域中總的、單倍型特定的和未定相的 lrWGS 覆蓋范圍的拷貝數(shù)。顯示正常對(duì)照樣本（種系 [GL]）中的中值拷貝數(shù)以供比較。垂直線表示用于識(shí)別 chr17p CNV 的 FISH 探針的邊界。對(duì)于 P11603_109，指示了獲得的 TP53 突變（使用 lrWGS 數(shù)據(jù)檢測(cè)）的位置。VAF，變異等位基因頻率。

總的來(lái)說(shuō)，這表明 lrWGS 可以高效地識(shí)別 CNV。然而，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析的數(shù)據(jù)表明，應(yīng)謹(jǐn)慎驗(yàn)證 WGS 在具有潛在廣泛和復(fù)雜的亞克隆拷貝數(shù)變化的腫瘤中預(yù)測(cè)的染色體數(shù)。

識(shí)別雙重打擊TP53 失活

多發(fā)性骨髓瘤中的雙重打擊TP53 失活與不良結(jié)果相關(guān)，即使采用新療法也是如此。這促使佳學(xué)基因仔細(xì)調(diào)查多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析的患者隊(duì)列中是否存在此類事件。在分階段 lrWGS 數(shù)據(jù)中可以很容易地觀察到單倍型特異性染色體 17p 缺失（圖 2C)?；?CNV 的計(jì)算調(diào)用，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析確定了 8 名 CNV 患者中的 7 名 (87.5%) 涉及TP53基因座。通過(guò) FISH 在 24% 的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 lrWGS 數(shù)據(jù)中鑒定的克隆參與賊低的 17p 缺失。相比之下，僅在 14% 的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 FISH 鑒定的未檢測(cè)到的 17p 缺失。接下來(lái)，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析使用 Sarek 確定了獲得性突變，并分析了多發(fā)性骨髓瘤中反復(fù)突變的基因的序列變化。多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析確定了 2 名移碼突變對(duì) TP53 功能有害的患者。先進(jìn)個(gè)是亞克隆的，出現(xiàn)在 TP53 位點(diǎn) (P13756_103) 正常的患者身上。相比之下，第二個(gè)突變接近克?。ù嬖谟诨颊?P11603_109 ≥ 80% 的讀數(shù)中）并與克隆 17p 缺失同時(shí)發(fā)生（圖 2C, 右), 表明該患者在診斷時(shí)表現(xiàn)為高風(fēng)險(xiǎn)雙重打擊 TP53多發(fā)性骨髓瘤。

原發(fā)生發(fā)性骨髓瘤IGH 基因座易位很容易通過(guò) lrWGS 識(shí)別

SV 可以在 lrWGS 數(shù)據(jù)中識(shí)別為跨越染色體斷點(diǎn)周圍區(qū)域的讀取云的富集（圖 3A)。這可用于識(shí)別易位、模板化插入、局部放大和其他復(fù)雜的 SV（圖 3B-C）。多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析使用 Long Ranger 和 GROCS-SVs 來(lái)調(diào)用染色體間 SV。這種方法在所有樣本中識(shí)別出 198 個(gè) SV（圖 4A)。盡管 3 例 HRD多發(fā)性骨髓瘤未檢測(cè)到 SV，但在 HRD 和非 HRD 病例之間未發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣本的結(jié)構(gòu)性變異（SV)數(shù)量存在顯著差異（圖 4B).

圖 3：SV 在 lrWGS 中被識(shí)別為跨斷點(diǎn)讀取云的豐富。(A) 跨越 4 號(hào)染色體 (chr4) 到 chr8 易位斷點(diǎn)的讀取云和構(gòu)成讀取云的對(duì)端讀取的示意圖。(B) 熱圖顯示通過(guò)相互易位融合的 chr4 和 chr8 區(qū)域之間共享讀取云（條形碼）的豐富。隨著共享讀取云的富集逐漸增加，接近斷點(diǎn)，熱圖中的信號(hào)類似于指向斷點(diǎn)的 2 個(gè)箭頭。實(shí)際上，這允許確定相互易位導(dǎo)致 chr4 β-區(qū)域與 chr8 a-區(qū)域 (i) 以及 chr4 α-區(qū)域與 chr8 b-區(qū)域 (ii) 的融合。連接的綠色和橙色箭頭示意性地表示事件 i 和 ii 連接的區(qū)域。(C) 相互易位產(chǎn)生的衍生染色體示意圖。

圖 4：跨斷點(diǎn)讀取云允許識(shí)別和重建 IGH 易位事件。(A) 涉及 HRD 和非 HRD多發(fā)性骨髓瘤中鑒定的不同染色體的結(jié)構(gòu)性變異（SV)總數(shù)。(B) HRD（左）和非 HRD 多發(fā)性骨髓瘤（右）中涉及不同染色體的結(jié)構(gòu)性變異（SV)數(shù)量。(C) 熱圖顯示 IGH 基因座（染色體 14 [chr14]）和 chr4 (多發(fā)性骨髓瘤SET)、chr11 (CCND1) 和 chr16 (MAF) 上的斷點(diǎn)區(qū)域之間共享的讀取云數(shù)。連接的綠色和橙色箭頭示意性地表示易位連接的區(qū)域。SV 的類型顯示在讀取云簇旁邊。如果所描繪的結(jié)構(gòu)性變異（SV)是更復(fù)雜結(jié)構(gòu)性變異（SV)的一部分，則會(huì)指出這一點(diǎn)。FISH 發(fā)現(xiàn)的攜帶指定易位的細(xì)胞百分比顯示在每個(gè)熱圖上方的括號(hào)中。水平（紅色）和垂直（紫色灰色）線分別標(biāo)記指定基因和 IGH VDJ 區(qū)域的位置。(D) P14402_119 中 chr11（左上）、從 chr11 到 chr14（右上）和 chr14（右下）的讀取云重疊。軌道以 t(11;14)多發(fā)性骨髓瘤顯示 H3K27Ac 信號(hào)（中值±標(biāo)準(zhǔn)偏差 [SD]）。連接的綠色和橙色線示意性地表示事件 i 到 iv 連接的區(qū)域。(E) P14402_119 中衍生染色體的示意圖，由 lrWGS 確定。t(nr)，單向易位；t(r)，相互易位; t(r)+fa，相互易位與斷點(diǎn)區(qū)域的局灶性放大。 

為了識(shí)別 IGH 易位，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析使用Loupe可視化了常見(jiàn)的 t(4;14)、t(11;14) 和 t(14;16) 斷點(diǎn)區(qū)域。多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)易位可以很容易地通過(guò)跨斷點(diǎn)讀取云的豐富在視覺(jué)上識(shí)別（圖 4C; ）。富集對(duì)單個(gè) IGH 易位事件具有高度特異性，并且可以清楚地與背景信號(hào)區(qū)分開(kāi)來(lái)。在計(jì)算上稱為 SV中，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn) 16 個(gè)多發(fā)性骨髓瘤具有涉及多發(fā)性骨髓瘤SET、CCND1或MAF基因座的 IGH 易位。總體而言，在 FISH 識(shí)別的 17 個(gè) IGH 易位中，有 16 個(gè)（94%）被 lrWGS 發(fā)現(xiàn)，并且沒(méi)有出現(xiàn)假陽(yáng)性。未識(shí)別的 t(11;14) 是亞克隆的（28% 的細(xì)胞），并且在目視檢查時(shí)識(shí)別出支持結(jié)構(gòu)性變異（SV)存在的讀取云。

總之，這表明 lrWGS 允許正確識(shí)別 SV，包括常見(jiàn)的 IGH 易位。

t(11;14) 與 3'RR IGH 增強(qiáng)子區(qū)域的擴(kuò)增有關(guān)

根據(jù) IGH 易位事件經(jīng)常由于錯(cuò)誤的類別轉(zhuǎn)換重組而發(fā)生的觀點(diǎn)， IGH 易位位于 IGHJ 區(qū)域的著絲粒側(cè)（圖 4C）。具體觀察 t(4;14) 和 t(14;16)，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)它們都是相互的，14 號(hào)染色體斷點(diǎn)發(fā)生在 Eμ 和 3'RR 增強(qiáng)子區(qū)域（側(cè)翼 IGHA1/2 區(qū)域). 同樣，大約一半（9 個(gè)中的 5 個(gè)）t(11;14) 事件是常規(guī)易位（圖 4C）將 3'RR 與 CCND1 基因座并列。有趣的是，1 個(gè) t(14;16)相互易位和 3 個(gè) t(11;14) 是復(fù)雜結(jié)構(gòu)性變異（SV)的一部分，在 IGH 基因座外有額外的斷點(diǎn)連接。

剩余的 t(11;14) 多發(fā)性骨髓瘤（9 個(gè)中的 4 個(gè)）呈現(xiàn)讀取云簇模式，表明影響斷點(diǎn)區(qū)域的更復(fù)雜事件（圖 4C）。其中三名患者（P14402_119、P17004_1001 和 P13172_102）具有相似的模式，具有 3 個(gè)重疊的讀取云簇。分析 P14402_119 中克隆 t(11;14) 的讀數(shù)云重疊，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)該模式與相互易位一致 (圖 4Di-iib）在攜帶CCND1的衍生染色體上攜帶易位斷點(diǎn)區(qū)域的焦點(diǎn)擴(kuò)增（圖 4Dii-iv,E). 這可以通過(guò) 11 號(hào)染色體上的拷貝數(shù)增加來(lái)推斷（圖 4D, β 區(qū)）和 14 號(hào)染色體（圖 4D, bc 區(qū)域), 14 號(hào)染色體上擴(kuò)增區(qū)域的著絲粒 (5') 和端粒 (3') 末端之間的共享讀數(shù)云 (圖 4Div, bc 區(qū)域），讀取云在中間重疊與 2 個(gè)獨(dú)立事件兼容，其中 1 個(gè)在 β 區(qū)域末端附近突然結(jié)束，重疊讀取云沒(méi)有逐漸減少（圖4Diia) 和 1 顯示了一個(gè)傳統(tǒng)模式，隨著離斷點(diǎn)距離的增加，共享讀取云的數(shù)量逐漸減少 (圖 4Diib). 其他 2 個(gè)具有類似讀取云模式且涉及重疊區(qū)域的案例（P17004_1001 和 P13172_102）可以用相同的方式解決。此外，P14402_119 中的 IGH 易位是復(fù)雜結(jié)構(gòu)性變異（SV)的一部分，在 IGH 和 CCND1 基因座之外發(fā)生額外的易位（補(bǔ)充圖 9）。觀察第四個(gè)案例 (P14402_120)，它有一個(gè)不同的模式，有 2 個(gè)（在基因組位置方面）部分重疊的讀取云簇，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析得出結(jié)論，這個(gè)模式代表了在焦點(diǎn)放大內(nèi)發(fā)生的相互易位，導(dǎo)致重復(fù)的側(cè)翼區(qū)域在易位斷點(diǎn)的任一側(cè)（補(bǔ)充圖 10）。將涉及的區(qū)域與 H3K27Ac（標(biāo)記活性基因調(diào)控元件）ChIPseq 數(shù)據(jù)重疊，圖 4D）。正如預(yù)期的那樣，這與CCND1的非常高的表達(dá)相關(guān)（所有 4 名患者均 > 1000 TPM）。

總之，這表明 t(11;14) 事件通常與CCND1基因座和 IGH 基因座的 3'RR 的擴(kuò)增有關(guān)。此外，正如預(yù)期的那樣，IGH 易位常常是復(fù)雜結(jié)構(gòu)變 劃的（17 個(gè)案例中的 5 個(gè)）的一部分。

lrWGS 允許檢測(cè)和解析影響 MYC 基因座的各種 SV

MYC易位已被證明與不良結(jié)果有關(guān)。涉及MYC基因座的SV通常很復(fù)雜，涉及局部擴(kuò)增、插入和易位，基因解碼認(rèn)為易位使得基因位于強(qiáng)增強(qiáng)子元件附近從而使MYC表達(dá)失調(diào)。依靠結(jié)構(gòu)性變異（SV)的計(jì)算識(shí)別，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)性變異（SV)影響37 名患者中的 9 名（24％）的MYC基因座，IGL 區(qū)域是少有反復(fù)涉及的基因座（2 9 例）。已識(shí)別的結(jié)構(gòu)性變異（SV)由不同的讀取云集群支持（圖 5A) 可以很容易地從背景中區(qū)分出來(lái)，在 1 個(gè)案例 (P14402_117) 中，該事件是更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)性變異（SV)的一部分。大多數(shù)已識(shí)別的MYC SV 是簡(jiǎn)單易位（9 個(gè)中有 5 個(gè)；圖 5A). 仔細(xì)觀察具有重疊讀取云簇的其余案例，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析得出結(jié)論，這些案例代表了帶有模板插入的焦點(diǎn)放大（圖 5A-B) 或相互易位 (圖 5A、C). 這兩種結(jié)構(gòu)性變異（SV)在MYC基因座都進(jìn)行了分析。正如預(yù)期的那樣，基因解碼發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)性變異（SV)影響包含MYC和PVT1啟動(dòng)子的區(qū)域（9 例中的 6 例）或PVT1基因的端粒區(qū)域（9 例中的 3 例），這此區(qū)域都含有影響MYC的元素基因。影響 PVT1 側(cè)翼增強(qiáng)子區(qū)域的所有 3 個(gè)結(jié)構(gòu)性變異（SV)通過(guò)插入（P14402_118 和 P11603_101；圖 5B）或通過(guò)相互易位（P13756_108；圖 5C）導(dǎo)致該元件與來(lái)自另一條染色體的骨髓瘤活性基因調(diào)控元件并置。同樣，在大多數(shù)情況下，影響MYC / PVT1啟動(dòng)子區(qū)域的易位導(dǎo)致MYC基因座與來(lái)自不同基因組位置的骨髓瘤活性元件并列，包括 JCHAIN 和 IGL 基因座?？傮w而言，具有MYC SV 的多發(fā)性骨髓瘤表達(dá)的MYC水平高于具有正常MYC基因座的多發(fā)性骨髓瘤病例，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 5:lrWGS 可以識(shí)別影響 MYC 基因座的各種 SV。(A) 熱圖顯示 MYC 基因座和指示的基因組位置之間共享的讀取云的數(shù)量。顯示了來(lái)自檢測(cè)到影響基因組 MYC 區(qū)域的結(jié)構(gòu)性變異（SV)的患者 (n = 9) 的數(shù)據(jù)。連接的綠色和橙色箭頭示意性地表示結(jié)構(gòu)性變異（SV)連接的區(qū)域。SV 的類型顯示在讀取云簇旁邊。圖 3 提供了有關(guān)讀取云模式解釋的詳細(xì)信息。如果所描繪的結(jié)構(gòu)性變異（SV)是更復(fù)雜結(jié)構(gòu)性變異（SV)的一部分，則會(huì)指出這一點(diǎn)。(BC) P14402_118 (B) 中 chr8 和 chr5 或 P13756_108 (C) 中 chr12 上的 MYC 基因座之間的讀取云重疊。在面板 BC 中，指出了用于解析衍生基因座結(jié)構(gòu)的特征 (i-ii)；右側(cè)顯示了衍生染色體區(qū)域的示意圖；和軌跡顯示指定多發(fā)性骨髓瘤亞型和漿母細(xì)胞 (PB) 中涉及區(qū)域的 H3K27Ac 信號(hào)（中值±標(biāo)準(zhǔn)偏差 [SD]）。fa+ti，在局灶性放大中發(fā)生的模板化插入；fa+t(r)，局灶性放大中發(fā)生的相互易位；t(nr)，單向易位；t(r)，相互易位。

總之，這表明MYC基因座受到多發(fā)性骨髓瘤中各種結(jié)構(gòu)性變異（SV)的影響，并且可以使用 lrWGS 檢測(cè)和結(jié)構(gòu)解析這些 SV。

個(gè)體特異性結(jié)構(gòu)性變異（SV)導(dǎo)致 MAFA 和 MAP3K14 的過(guò)度表達(dá)

為了確定是否可以找到可能代表潛在主要或高風(fēng)險(xiǎn)變異的其他 SV，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析調(diào)查了是否可以識(shí)別影響先前被發(fā)現(xiàn)是 IGH 基因座易位伙伴的位點(diǎn)的私有 SV。這確定了 P13172_104 中涉及MAFA基因座的 at(1;8) 和涉及MAP3K14基因座的 P13172_101 中的 at(6;17) 。

患者 P13172_104 有 2 個(gè) SV，涉及 1 號(hào)和 8 號(hào)染色體，第二個(gè)并列MAFA和 TENT5C 位點(diǎn)（圖 6A-C). 對(duì)斷點(diǎn)區(qū)域中讀取云的分析表明，涉及MAF的 SV是克隆的。仔細(xì)觀察斷點(diǎn)，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)MAFA基因與通常位于TENT5C基因側(cè)翼的強(qiáng)多發(fā)性骨髓瘤活性增強(qiáng)子區(qū)域并列（圖 6C). H3K27Ac ChIPseq 證實(shí)TENT5C側(cè)翼增強(qiáng)子和MAFA近端元件在 P13172_104 的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中都具有高度活性。因此，這強(qiáng)烈表明 TENT5C 增強(qiáng)子導(dǎo)致 MAFA 基因的激活。與此一致，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析在 P13172_104 的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了非常高的MAFA表達(dá)（~1000 TPM）（圖 6D). 鑒于 MAFA 是 Maf 轉(zhuǎn)錄因子家族的一部分，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析接下來(lái)想要評(píng)估MAFA過(guò)度表達(dá)是否會(huì)導(dǎo)致類似于 t(14;16)（MAF過(guò)度表達(dá)）多發(fā)性骨髓瘤 中的基因調(diào)控情況。查看多發(fā)性骨髓瘤亞組特定的 H3K27Ac 信號(hào)，所有樣本的層次聚類顯示 P13172_104 與 t(14;16)多發(fā)性骨髓瘤聚類并與MAF過(guò)表達(dá)組共享 H3K27Ac 特征（圖 6E). 因此，在 P13172_104 中看到的私有 t(1;8) 易位導(dǎo)致 MAFA 的過(guò)表達(dá)和 MAF 型基因調(diào)控景觀的建立。

圖 6：私有 SV 導(dǎo)致大量 MAFA 過(guò)表達(dá)并重新編程為 MAF 型多發(fā)性骨髓瘤。(A) 熱圖顯示 1 號(hào)染色體 (chr1) 和 chr8 上指示區(qū)域之間共享的讀取云數(shù)。連接的綠色和橙色箭頭示意性地表示結(jié)構(gòu)性變異（SV)連接的區(qū)域。指示結(jié)構(gòu)性變異（SV)的類型。(B) 衍生染色體的示意圖。(C) 在 t(1;8) 涉及的區(qū)域中顯示 H3K27Ac 信號(hào)（中值±標(biāo)準(zhǔn)偏差 [SD]）的軌道。(D) MAFA 的表達(dá)。(E) H3K27Ac 標(biāo)記區(qū)域的行歸一化層次聚類熱圖，顯示多發(fā)性骨髓瘤亞型之間的差異信號(hào)。PB，漿母細(xì)胞；t(nr)，單向易位。

影響MAP3K14基因座的結(jié)構(gòu)性變異（SV)在結(jié)構(gòu)上構(gòu)成了 17 號(hào)染色體上的局灶性擴(kuò)增，攜帶 6 號(hào)染色體小區(qū)域的模板化插入（圖 7A-B). 讀取云重疊分析表明結(jié)構(gòu)性變異（SV)是亞克隆的。分析相關(guān)區(qū)域，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)性變異（SV)將通常位于 BMP6 基因側(cè)翼的增強(qiáng)子區(qū)域與 17 號(hào)染色體上的擴(kuò)增區(qū)域并列（圖 7B). 后者包含MAP3K14基因的一部分，但缺少賊 3' 外顯子，表明擴(kuò)增不會(huì)產(chǎn)生該基因的 2 個(gè)功能拷貝。與失調(diào) MAP3K14 基因的BMP6側(cè)翼元件一致，P13172_101 中的表達(dá)很高（>300 TPM），幾乎比任何其他研究的多發(fā)性骨髓瘤高 10 倍（圖 7C). 由于MAP3K14作為NF - κB的激活劑發(fā)揮作用，這可能表明攜帶該結(jié)構(gòu)性變異（SV)的多發(fā)性骨髓瘤亞克隆可能具有升高的或組成型的 NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)。

圖 7：BMP6 側(cè)翼增強(qiáng)子區(qū)域的插入導(dǎo)致 MAP3K14 的過(guò)度表達(dá)。(A) 熱圖顯示 6 號(hào)染色體 (chr6) 和 chr17 上指示區(qū)域之間共享的讀取云數(shù)。連接的綠色和橙色箭頭示意性地表示結(jié)構(gòu)性變異（SV)連接的區(qū)域。指示結(jié)構(gòu)性變異（SV)的類型。(B) 派生染色體的示意圖和顯示結(jié)構(gòu)性變異（SV)所涉及區(qū)域中 H3K27Ac 信號(hào)（中值±標(biāo)準(zhǔn)偏差 [SD]）的軌道。(C) MAP3K14 的表達(dá)。fa+ti，發(fā)生在局灶性放大中的模板化插入。

對(duì)于大多數(shù)患者而言，多發(fā)性骨髓瘤仍然是一種無(wú)法治好的疾病，預(yù)后不佳。因此，制定在臨床常規(guī)中提供全面基因解碼基因檢測(cè)的策略對(duì)于了解個(gè)體患者的疾病和建立旨在改善結(jié)果和生存的個(gè)性化醫(yī)療計(jì)劃具有至關(guān)重要的意義。

在這里，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析進(jìn)行了一項(xiàng)涉及 37 名多發(fā)性骨髓瘤患者的原理驗(yàn)證研究，并證明 lrWGS 可用于提供多發(fā)性骨髓瘤的綜合基因解碼基因檢測(cè)信息。引人注目的是，lrWGS 通過(guò)簡(jiǎn)單地可視化跨越公共斷點(diǎn)區(qū)域的讀取云，提供了對(duì)經(jīng)常性 IGH 和 IGL 易位的正確和直接的識(shí)別。鑒于讀取云簇的特殊性，即使沒(méi)有計(jì)算分析（除了基礎(chǔ)處理）或種系控制，也可以快速識(shí)別這些 SV。在臨床環(huán)境中，這很有吸引力，因?yàn)樗试S在更耗時(shí)的整體分析之前快速篩選常見(jiàn) SV。例如影響 IGH 和MYC的 SVloci，讀取云簇的分析可以比 FISH 或傳統(tǒng) WGS 更簡(jiǎn)單、更正確地識(shí)別和解析不同的 SV?？偟膩?lái)說(shuō)，考慮到 lrWGS 和 FISH 之間的高度一致性，這表明 lrWGS 可以作為一個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)，可以減少用光學(xué)映射或其他旨在映射結(jié)構(gòu)性變異（SV)的技術(shù)來(lái)補(bǔ)充基于測(cè)序的分析的需要。

利用對(duì) lrWGS 數(shù)據(jù)中的遺傳畸變進(jìn)行整體分析的可能性，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析確定了與不良結(jié)果相關(guān)的反復(fù)性和個(gè)體物異性事件，這些事件在當(dāng)前的臨床常規(guī)遺傳學(xué)中不能被基于數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)。在反復(fù)性變異中，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了 t(8;22) MYC-IGL 易位、高風(fēng)險(xiǎn)雙重打擊 TP53 失活和賊近與不良結(jié)果相關(guān)的染色體碎裂的病例。有趣的是，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析還可以發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致基因過(guò)度表達(dá)的個(gè)體獨(dú)特性結(jié)構(gòu)變異，這些基因先前被證明是 IGH 基因座的易位伴侶（MAP3K14和MAFA)。特別是，涉及 MAFA 基因的 t(1;8) 是值得注意的，因?yàn)樵摻Y(jié)構(gòu)變異可能代表一個(gè)替代的主要事件，其分子等同于具有相似患者風(fēng)險(xiǎn)特征和先天性的MAF的 t(14;16) 放松管制對(duì)蛋白酶體抑制劑的抗性。此外，多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)具有 t(11;14) 的樣本通常攜帶 3'RR 和 CCND1 區(qū)域的重復(fù)。所分析的 t(11;14)多發(fā)性骨髓瘤是隨機(jī)包含的事實(shí)表明這是一種相當(dāng)普遍的現(xiàn)象，在復(fù)雜結(jié)構(gòu)性變異（SV)插入期中有和沒(méi)有衍生 t(11;14) 染色體參與的情況下都可以發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象

名義上，lrWGS 可以在非常有限數(shù)量的細(xì)胞（≤1000 個(gè)細(xì)胞或 1-5 ng DNA）上進(jìn)行，但對(duì) HMW DNA 制劑的需求有效地阻止了這一點(diǎn)。正如多發(fā)性骨髓瘤的深度基因檢測(cè)及大數(shù)據(jù)分析所做的那樣，避免 DNA 制備的需要，以充分利用對(duì)輸入材料的低要求，這對(duì)如何在多發(fā)性骨髓瘤和其他血液惡性腫瘤中進(jìn)行常規(guī)基因解碼基因檢測(cè)具有有趣的意義。通過(guò)在 FACS 中運(yùn)行診斷流式細(xì)胞術(shù)，可以對(duì)任何明確的腫瘤或正常細(xì)胞群進(jìn)行基于 lrWGS 的基因解碼分析。鑒于所需的細(xì)胞數(shù)量較少，這甚至可以在預(yù)期腫瘤細(xì)胞很少或數(shù)量較少的樣本上進(jìn)行，包括來(lái)自細(xì)針活檢的樣本或?yàn)橘\小殘留疾病分析采集的樣本。這種方法將同時(shí)允許對(duì)純靶細(xì)胞群在進(jìn)行深度基因檢測(cè)分析的同時(shí)進(jìn)行 RNA 測(cè)序和其他分析。賊近引入的自動(dòng)化程度更高的 FACS 有可能使這種分析工作流程在診斷流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施變得可行。

盡管從市場(chǎng)上移除 Chromium Genome 無(wú)疑阻礙了 lrWGS 的更廣泛引入，但已經(jīng)出現(xiàn)了其他幾個(gè)平臺(tái)來(lái)取而代之，包括單管長(zhǎng)片段讀取、轉(zhuǎn)座酶聯(lián)長(zhǎng)讀取測(cè)序、和液滴條形碼測(cè)序。雖然必須進(jìn)行更大規(guī)模的驗(yàn)證研究以證明這些可以有效地取代 10X 平臺(tái)，但轉(zhuǎn)座酶酶聯(lián)長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序?qū)嶒?yàn)方案的簡(jiǎn)單工作流程使其成為潛在臨床實(shí)施的有趣候選者。

總之，lrWGS 可以相對(duì)輕松地識(shí)別和解析不同結(jié)構(gòu)性變異（SV)的結(jié)構(gòu)，使其成為在多發(fā)性骨髓瘤和其他具有復(fù)雜基因組的血液惡性腫瘤中提供全面的基因檢測(cè)分析的有吸引力的解決方案。此外，在診斷中使用 FACS 可以促進(jìn)純腫瘤細(xì)胞的 lrWGS 以及表達(dá)和表觀遺傳水平的基因測(cè)序分析。這可以為了解個(gè)體患者的潛在基因檢測(cè)基礎(chǔ)和疾病機(jī)制提供一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)。