2021-08-27發(fā)布2022-01-01實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布前言

本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會(huì)負(fù)責(zé)技術(shù)審查和技術(shù)咨詢，由國(guó)家衛(wèi)生健康委醫(yī)管中心負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)性和格式審查，由國(guó)家衛(wèi)生健康委醫(yī)政醫(yī)管局負(fù)責(zé)業(yè)務(wù)管理、法規(guī)司負(fù)責(zé)統(tǒng)籌管理。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：北京醫(yī)院、北京市紅十字血液中心、中華骨髓庫(kù)管理中心、浙江省血液中心、遼寧省血液中心。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蔡劍平、張志欣、肖堯、黑愛蓮、周曉陽(yáng)、王琳、戴大鵬、張立群、朱發(fā)明、李劍平。

引言

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）又稱移植抗原，與同種異體組織器官移植以及移植物的排斥反應(yīng)相關(guān)。存在于細(xì)胞膜表面的HLA分子可以結(jié)合來自細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的肽，形成HLA-肽復(fù)合物，抗原遞呈細(xì)胞將該復(fù)合物遞呈給T細(xì)胞引起一系列的免疫反應(yīng)。

隨著對(duì)HLA研究的深入，20世紀(jì)中葉誕生的器官移植和造血干細(xì)胞移植技術(shù)已成為臨床醫(yī)學(xué)治療和拯救患者生命的重要手段，數(shù)以百萬計(jì)的患者通過器官移植和造血干細(xì)胞移植獲得了新生。近二十年來，隨著對(duì)免疫抑制劑、HLA配型、HLA抗體檢測(cè)和監(jiān)測(cè)等存活率影響因素的認(rèn)識(shí)，器官移植和造血干細(xì)胞移植存活率得到了顯著的改善。HLA組織配型是影響器官移植和造血干細(xì)胞移植存活率及受者生存質(zhì)量的重要因素之一。

HLA基因具有高度的多態(tài)性，決定了所表達(dá)的HLA抗原分子的多態(tài)性。隨著聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chainreaction，PCR)技術(shù)在臨床應(yīng)用的日益廣泛，從20世紀(jì)80年代末開始HLA分型已從過去主要采用血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)過渡到以基因分型檢測(cè)技術(shù)為主?；蚍中蜋z測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、正確度高、能檢測(cè)出血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法無法檢出的基因型別等優(yōu)點(diǎn)，還具有不排斥原有血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)所闡述信息的優(yōu)點(diǎn)。HLA基因分型檢測(cè)技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、檢測(cè)的技術(shù)流程以及質(zhì)量控制等提出了更高的要求。長(zhǎng)期以來我國(guó)一直缺乏HLA基因分型檢測(cè)技術(shù)體系的規(guī)范及要求，在一定程度上影響了HLA基因分型整體檢測(cè)水平的提高和臨床器官移植、造血干細(xì)胞移植標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程。

本標(biāo)準(zhǔn)擬建立適用于我國(guó)國(guó)情的HLA基因分型檢測(cè)技術(shù)體系的規(guī)范及要求，旨在提高我國(guó)HLA基因分型實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)水平，更有效地服務(wù)于與HLA相關(guān)的臨床診療工作。

人類白細(xì)胞抗原基因分型檢測(cè)體系技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了HLA基因分型檢測(cè)體系的技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于所有開展人體標(biāo)本HLA基因分型檢測(cè)，提供與臨床疾病的診療、預(yù)防、用藥監(jiān)測(cè)或者移植以及人體健康評(píng)估相關(guān)報(bào)告的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，也適用于開展捐獻(xiàn)者HLA基因分型數(shù)據(jù)入庫(kù)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和對(duì)HLA檢測(cè)進(jìn)行質(zhì)量控制的實(shí)驗(yàn)室。

2規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1

IPD-IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(kù) Immuno-Polymorphism Database (IPD)- international ImMunoGeneTics project (IMGT)/HLA database

人類主要組織相容性復(fù)合物的 DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)，包含經(jīng)世界衛(wèi)生組織 HLA命名委員會(huì)命名的 HLA等位基因序列。

1. 1. 3.2基于直接測(cè)序的基因分型 sequence based typing,SBT

       

   2. 基于核酸直接測(cè)序技術(shù)的基因分型方法。
   1. 3.3基于序列特異性引物的基因分型 sequence-specific primer,SSP

       

   2. 采用等位基因特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增的基因分型方法。
   1. 3.4基于序列特異性寡核苷酸雜交的基因分型 sequence-specific oligonucleotide,SSO

       

   2. 采用特異性序列的寡核苷酸進(jìn)行核酸雜交的基因分型方法。
   1. 3.5基因型 genotype

       

   2. 某一基因或一組基因的具體等位基因組合。
   1. 3.6基因座 locus

       

   2. 基因在染色體上的位置，同一座位上可能有不同類型的等位基因；或一段DNA序列在染色體上的位置。
2. 3.7擦拭檢測(cè) wipe test

    

是一種通過擦拭物體表面來監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和臺(tái)面是否被核酸污染的檢測(cè)方法。

4環(huán)境和設(shè)施要求

1. 1環(huán)境

    

2. 1.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充足的空間，以便所有操作過程和檢測(cè)分析能夠正常運(yùn)行，區(qū)域間應(yīng)避免相互干擾。

    

3. 1.2實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)區(qū)域應(yīng)分為“清潔區(qū)”和“污染區(qū)”，進(jìn)行有效隔離并采取措施以防止核酸交叉污染。

    

4. 1.3應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度、濕度進(jìn)行監(jiān)控并記錄。

    

5. 2設(shè)施

    

6. 2.1存放試劑和標(biāo)本的冰箱或者冰柜應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)的需要。

    

7. 2.2照明和通風(fēng)設(shè)備及緊急噴淋、洗眼器等應(yīng)急設(shè)備應(yīng)與實(shí)驗(yàn)檢測(cè)要求相適應(yīng)。

    

8. 2.3保存記錄的設(shè)施應(yīng)滿足檔案管理要求。使用中的記錄和存檔記錄的保存位置清晰可辨且易于查找。

    

9. 2.4需要控制溫度的儀器應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求調(diào)節(jié)到最佳溫度，定期對(duì)其溫度進(jìn)行監(jiān)控和記錄。

    

10. 2.5關(guān)鍵儀器設(shè)備應(yīng)配置無間斷電源。

     

11. 2.6設(shè)備應(yīng)由經(jīng)過授權(quán)的人員操作，專人管理。

     

12. 2.7設(shè)備及其軟件應(yīng)有唯一性標(biāo)識(shí)，并保存記錄。

     

13. 2.8儀器設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)，并保存維護(hù)、維修記錄。

     

14. 2.9應(yīng)根據(jù)需求變化或硬件環(huán)境的變化對(duì)應(yīng)用程序進(jìn)行部分或全部的升級(jí)，并對(duì)升級(jí)后的軟件進(jìn)行性能評(píng)估。依據(jù) IPD-IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(kù)的更新，至少每年一次對(duì)本地 HLA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行更新，并針對(duì)更新后的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行性能評(píng)估。

     

15. 3生物、化學(xué)和物理危險(xiǎn)性

     

    1. 3.1生物危險(xiǎn)性

        

    2. 所有人類標(biāo)本（包括血樣、組織等）均應(yīng)被認(rèn)作感染性的樣本來處置，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)檢測(cè)工作進(jìn)行相應(yīng)的生物安全等級(jí)備案。
    1. 3.2化學(xué)危險(xiǎn)性

        

    2. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過程可能使用含有毒性的或致突變的化學(xué)物質(zhì)（如氯仿、溴化乙啶和苯酚），每一種化學(xué)品的使用應(yīng)遵循我國(guó)對(duì)化學(xué)品使用的相關(guān)規(guī)定。
16. 3.3物理危險(xiǎn)性

     

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過程可能遇到具有潛在的物理危險(xiǎn)性（如電泳儀、紫外線及離心設(shè)備），應(yīng)遵循相應(yīng)儀器的操作規(guī)則。

5試劑耗材的采購(gòu)和儲(chǔ)存

1. 1通用要求

    

2. 1.1應(yīng)制定并執(zhí)行檢測(cè)試劑、耗材的選擇、購(gòu)買、接收和儲(chǔ)存的程序。

    

3. 1.2購(gòu)買的檢測(cè)試劑、耗材，驗(yàn)收合格后方可使用并保留驗(yàn)收記錄。

    

4. 1.3應(yīng)對(duì)影響檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵耗材、試劑供應(yīng)商進(jìn)行評(píng)價(jià)，保存評(píng)價(jià)記錄和供應(yīng)商名錄。

    

5. 2試劑耗材評(píng)估

    

6. 2.1選購(gòu)影響檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵耗材、試劑前應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，產(chǎn)品質(zhì)量應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求。

    

7. 2.2更換試劑和耗材的生產(chǎn)商應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，產(chǎn)品質(zhì)量應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求。

    

8. 2.3使用新批號(hào)試劑前，應(yīng)對(duì)新、舊批號(hào)質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)。可采用平行檢測(cè)同一樣本或質(zhì)控品的方式，新批號(hào)質(zhì)量應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求。

    

9. 2.4影響檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵耗材、試劑應(yīng)確認(rèn)合格，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室主任或者授權(quán)人審批后才投入使用。

    

10. 3試劑的來源、制備及儲(chǔ)存

     

11. 3.1應(yīng)記錄影響檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵耗材和試劑的來源，包括制造商、供應(yīng)商、購(gòu)買日期、購(gòu)買人、試劑批號(hào)等，且易于查詢。

     

12. 3.2所有檢測(cè)試劑應(yīng)使用等級(jí)匹配的化學(xué)試劑配制，高效檢測(cè)試劑達(dá)到分子生物學(xué)等級(jí)水準(zhǔn)。

     

13. 3.3應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行試劑配制，并進(jìn)行記錄。

     

14. 3.4所有使用的試劑應(yīng)清晰標(biāo)記名稱、濃度、試劑特性、無菌狀態(tài)、試劑保存條件、配制人、配制日期或開啟日期、試劑有效期，并清晰標(biāo)示試劑毒性。

     

15. 3.5所有使用的商業(yè)試劑的儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)與制造商提供的說明書相一致。

     

16. 3.6商業(yè)或者自制的試劑、水、溶液、培養(yǎng)基、質(zhì)控品、校準(zhǔn)品及其他試劑，當(dāng)超過使用效期、性質(zhì)改變或質(zhì)量下降時(shí)，不應(yīng)使用。

     

17. 3.7使用商業(yè)試劑盒應(yīng)遵循制造商的說明書。

     

    1. 3.8應(yīng)記錄每次檢測(cè)使用試劑的批號(hào)或者貨號(hào)。

        

    2. 6樣本的采集和處理
18. 1患者或被檢測(cè)者信息

     

19. 1.1患者或被檢測(cè)者的送檢單信息內(nèi)容應(yīng)包括姓名、性別、出生日期（年齡）、采樣日期、樣本類型、送檢醫(yī)師姓名、臨床相關(guān)資料或?qū)嶒?yàn)室檢查資料，可酌情調(diào)整內(nèi)容。

     

20. 1.2樣本容器上應(yīng)標(biāo)注唯一性標(biāo)識(shí)。

     

21. 1.3患者或被檢測(cè)者信息表、樣本、驗(yàn)收記錄應(yīng)歸檔保存，便于分析和追溯。

     

22. 1.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確?；颊呋虮粰z測(cè)者信息的安全性和保密性。

     

23. 1.5患者或被檢測(cè)者的樣本被用于科研項(xiàng)目或商業(yè)項(xiàng)目時(shí)，應(yīng)經(jīng)過倫理審查和知情同意；如患者或被檢測(cè)者樣本僅進(jìn)行臨床檢測(cè)，則無需填寫知情同意書。

     

24. 2樣本采集

     

25. 2.1樣本采集前應(yīng)明確采集方法、采集部位和保存方式，準(zhǔn)備好采集器械。采集樣本類型可為外周血、口腔拭子、骨髓細(xì)胞、唾液、組織。

     

26. 2.2樣本采集應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，并進(jìn)行記錄。

     

27. 2.3采集樣本時(shí)應(yīng)注意影響樣本采集和質(zhì)量的因素，外周血推薦使用 EDTA等抗凝劑，不宜使用肝素抗凝。

     

28. 2.4采集的樣本應(yīng)具有唯一性標(biāo)識(shí)，并與送檢單一一對(duì)應(yīng)，可追溯患者姓名、出生日期、醫(yī)院編號(hào)或者實(shí)驗(yàn)室編號(hào)、樣本采集日期和采集時(shí)間。

     

29. 3樣本運(yùn)輸

     

30. 3.1樣本可以常溫或普通冰袋運(yùn)輸，防止反復(fù)凍融和污染。

     

31. 3.2樣本應(yīng)有運(yùn)輸清單信息，包括樣本編號(hào)、采集時(shí)間、采集實(shí)驗(yàn)室、采集人、樣本數(shù)量、患者信息、運(yùn)輸容器、運(yùn)輸方式和保存方式等。

     

32. 4樣本接收和驗(yàn)收

     

33. 4.1接收樣本時(shí)，應(yīng)做好接收驗(yàn)收記錄，包括樣本來源、類型、運(yùn)輸方法、運(yùn)輸容器、實(shí)驗(yàn)室接收樣本的日期、樣本質(zhì)量和數(shù)量、附帶資料等。

     

34. 4.2當(dāng)樣本信息不足、樣本處理或運(yùn)輸不當(dāng)、量不能滿足檢測(cè)、抗凝方式不當(dāng)，實(shí)驗(yàn)室可以拒收樣本并做好相應(yīng)記錄，通知送檢方重新送檢。

     

35. 4.3驗(yàn)收通過的樣本應(yīng)按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行編號(hào)并存儲(chǔ)樣本信息。

     

36. 4.4采集后的樣本可于 4℃暫存 2周，超出 2周宜在-20℃以下冰箱保存。樣本應(yīng)避免反復(fù)凍融和相互污染，盡早提取核酸。

     

37. DNA提取、檢測(cè)和保存

     

38. 5.1樣本基因組 DNA提取

     

39. 5.1.1可從多種類型的樣本中提取基因組 DNA，提取方法應(yīng)已獲得廣泛承認(rèn)，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證。

     

40. DNA時(shí)應(yīng)記錄所有操作步驟及試劑來源，操作步驟及試劑來源的任何變動(dòng)或?qū)嶒?yàn)過程中的任何異常現(xiàn)象也應(yīng)記錄，操作人應(yīng)簽字并注明實(shí)驗(yàn)日期。

     

41. 5.1.3應(yīng)設(shè)有獨(dú)立的 DNA提取操作區(qū)。操作區(qū)照明和通風(fēng)設(shè)備應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)要求，關(guān)鍵設(shè)備配置無中斷或緊急電源，并利用物理或生化手段防止污染。區(qū)域內(nèi)使用專用工作服、手套和一次性用品。

     

42. 5.1.4DNA提取前應(yīng)驗(yàn)證所有試劑質(zhì)量以及 DNA提取系統(tǒng)。應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程提取 DNA，操作手冊(cè)置于便于取閱的地方。

     

43. 5.1.5應(yīng)保留部分原始樣本，不應(yīng)全部用來提取 DNA，以便后續(xù)追溯和使用。

     

44. 5.1.6DNA提取完成后應(yīng)填寫提取記錄，包括樣本編號(hào)、提取時(shí)間、提取操作人、提取方式、樣本濃度和體積等。

     

45. 5.2DNA濃度的測(cè)定

     

46. 5.2.1對(duì)于要求高純度核酸的檢測(cè)方法，應(yīng)對(duì)獲取的 DNA進(jìn)行濃度和純度的檢測(cè)，可使用分光光度計(jì)法和電泳法。

     

47. 5.2.2分光光度計(jì)對(duì) DNA濃度測(cè)定前應(yīng)先校正，并設(shè)立合適的對(duì)照。DNA樣本被檢測(cè)時(shí)，應(yīng)高效其全部溶解且濃度均勻。核酸最大吸收波長(zhǎng)在 260 nm，1.0的光密度值相當(dāng)于雙鏈 DNA含量為 50 μg/mL；蛋白質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)在 280 nm處，因此測(cè)定 A260/A280比值，可判斷樣本中蛋白質(zhì)和 RNA污染的情況。比值在 1.8～2.0之間，說明 DNA純度高；比值小于 1.6，說明樣本中蛋白質(zhì)殘留較多；如果比值大于

     

1. RNA污染，建議重新抽提或純化。

    

2. 5.2.3電泳法常用來判斷 DNA的完整性和 RNA污染情況。

    

3. 5.2.4DNA濃度、純度和完整性應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)室使用試劑的要求。若不符合后續(xù)檢測(cè)的要求，應(yīng)重新抽提。

    

4. DNA的保存

    

基因組DNA可于4℃暫存2周，超出2周宜在-20℃以下冰箱保存。-20℃保存超過1年后再使用，應(yīng)先進(jìn)行DNA質(zhì)量評(píng)估，滿足實(shí)驗(yàn)要求方可使用。

7HLA基因分型檢測(cè)方法

1. 1聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）方法

    

   1. 1.1基本原理

       

   2. 根據(jù)HLA基因序列的多態(tài)性，設(shè)計(jì)一系列等位基因特異性引物，通過特定的PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增各等位基因的特異性DNA片段，產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，然后通過瓊脂糖 凝膠 電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)是否得到PCR產(chǎn)物以及產(chǎn)物的片段大小進(jìn)行HLA基因分型。PCR-SSP的3′端引物和靶DNA特異性結(jié)合后，Taq酶使配對(duì)引物的3′端延伸，但非配對(duì)的不延伸，所以只有當(dāng)靶DNA和上下游引物全部互補(bǔ)時(shí)才能有效擴(kuò)增。PCR-SSP引物體系的特異性是通過上下游引物特異性之間的交叉來實(shí)現(xiàn)的。
2. 1.2檢測(cè)設(shè)備及引物設(shè)計(jì)

    

3. 1.2.1必需的設(shè)備（包括但不限于）：96孔 PCR板、專用貼膜；單通道移液器、多通道移液器；96孔或 384孔模塊 PCR儀；電泳系統(tǒng)及核酸片段分析系統(tǒng)。

    

4. PCR-SSP法的 HLA基因分型技術(shù)，關(guān)鍵是正確設(shè)計(jì)特異性的引物。該引物序列應(yīng)與所檢測(cè)的 HLA等位基因序列相對(duì)應(yīng)，宜使用商業(yè)試劑盒。

    

5. 1.2.3PCR引物和引物混合物宜分裝保存。

    

6. 1.3結(jié)果分析及問題解決方法

    

   1. 1.3.1總述

       

   2. 每個(gè)PCR-SSP反應(yīng)，如果有內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增，則該反應(yīng)有效。如果一個(gè)反應(yīng)既沒有內(nèi)對(duì)照又沒有特異基因擴(kuò)增條帶，則該反應(yīng)失敗。如果一個(gè)反應(yīng)沒有內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增，即使這個(gè)等位基因在該反應(yīng)里被擴(kuò)增了，也被視為檢測(cè)失敗。等位基因的型別通過陽(yáng)性和陰性反應(yīng)的格局來判別。單孔反應(yīng)失敗時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
7. 1.3.2常見問題的可能原因及解決方法

    

   1. 1.3.2.1無等位基因和無內(nèi)對(duì)照片段擴(kuò)增

       

      1. PCR儀的問題，可用確認(rèn)的 DNA樣本對(duì)檢測(cè)試劑和 PCR儀進(jìn)行驗(yàn)證；

          

      2. b) DNA的質(zhì)量不符合要求，當(dāng) DNA濃度太低，可以適當(dāng)增加 DNA模板量，或增加 Taq酶量或兩者同時(shí)增加；

          

      3. c) Taq酶可能失效，更換 Taq酶。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)正確存儲(chǔ)和使用 Taq酶。

          

   1. 1.3.2.2整體擴(kuò)增條帶顯色強(qiáng)度弱

       

      1. a) PCR儀的問題，用確認(rèn)的 DNA樣本檢測(cè) PCR儀；

          

      2. b) DNA的質(zhì)量不符合要求，參照 7.1.3.2.1 b)；

          

      3. c) Taq酶質(zhì)量低或過度稀釋。應(yīng)提高 Taq酶濃度，確保 Taq酶正確保存和使用。每個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇合適的 Taq酶濃度；

          

      4. d) PCR相關(guān)試劑未正確保存、配制及使用，應(yīng)確保每一步驟嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，必要時(shí)更換新的試劑。

          

   1. 1.3.2.3單一位點(diǎn)出現(xiàn)多個(gè)等位基因擴(kuò)增條帶

       

      1. DNA受到污染，這種污染會(huì)在多個(gè)反應(yīng)孔中產(chǎn)生額外條帶，可能出現(xiàn)兩種樣本的反應(yīng)格局，應(yīng)重新提取樣本 DNA；

          

      2. b) PCR產(chǎn)物污染，這種污染會(huì)在單個(gè)或少數(shù)檢測(cè)位點(diǎn)產(chǎn)生額外條帶，應(yīng)使用新的試劑進(jìn)行重新擴(kuò)增；

          

      3. c) 可能是新的等位基因，應(yīng)使用其他分子生物學(xué)方法進(jìn)行確認(rèn)。

          

   1. 1.3.2.4多個(gè)或所有位點(diǎn)出現(xiàn)多個(gè)等位基因擴(kuò)增條帶

       

      1. DNA受到污染，這種污染大多數(shù)會(huì)在多個(gè)或所有基因位點(diǎn)的反應(yīng)孔中產(chǎn)生額外條帶，可能出現(xiàn)兩種樣本的反應(yīng)格局，應(yīng)重新提取樣本 DNA；

          

      2. b) PCR儀加熱系統(tǒng)錯(cuò)誤，如果 PCR程序被中斷或重啟（尤其是在早期階段），可以看到多條條帶，應(yīng)對(duì) PCR儀進(jìn)行檢修和校準(zhǔn)；

          

      3. PCR反應(yīng)液受到污染，應(yīng)重新采集樣本或配制新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

          

   1. 1.3.2.5一個(gè)基因位點(diǎn)上無特異性擴(kuò)增條帶

       

      1. a) PCR反應(yīng)液配制錯(cuò)誤，應(yīng)確保所有的 PCR反應(yīng)組份在使用前經(jīng)過驗(yàn)證；

          

      2. dNTP（ 脫氧核糖核苷 三磷酸）與 MgCl 2的比#20363;不合適，可影響一個(gè)或更多基因位點(diǎn)的擴(kuò)增，表現(xiàn)出在一個(gè)特殊的位點(diǎn)沒有等位基因，可調(diào)整 dNTP與 MgCl 2比例進(jìn)行再次測(cè)試；

          

      3. c) 如果某些等位基因有較高的 G/C含量，可因 Taq酶選擇不當(dāng)導(dǎo)致難以擴(kuò)增。應(yīng)更換合適的 Taq酶。

          

   1. 1.3.2.6有等位基因擴(kuò)增條帶但無內(nèi)對(duì)照條帶

       

      1. a) DNA降解，使分子量大的擴(kuò)增條帶難以產(chǎn)生，如內(nèi)對(duì)照無擴(kuò)增條帶，應(yīng)重新提取樣本 DNA；

          

      2. b) PCR延伸時(shí)間不足，應(yīng)增加 PCR反應(yīng)延伸時(shí)間；

          

      3. c) PCR儀故障，應(yīng)重新校準(zhǔn) PCR儀；

          

      4. d) 內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增引物濃度過低，應(yīng)提高引物濃度。

          

   1. 1.3.2.7有內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增條帶但無等位基因條帶

       

      1. a) 鎂離子濃度過高，應(yīng)重新配制 PCR擴(kuò)增試劑；

          

      2. b) PCR儀蓋壓力不夠，應(yīng)確保 PCR儀蓋和 PCR管/板之間的壓力匹配。

          

   1. 1.3.2.8部分分型結(jié)果清晰，部分分型結(jié)果失敗

       

      1. a) PCR儀加熱系統(tǒng)故障，應(yīng)確保 PCR儀加熱模塊的一致性；

          

      2. PCR儀加熱模塊不匹配，應(yīng)確保 PCR管/板的底部直接接觸 PCR儀加熱模塊；

          

      3. c) PCR儀蓋壓力不均勻，應(yīng)確保 PCR儀蓋和 PCR管/板之間的壓力匹配；

          

      4. d) 凝膠電泳時(shí)核酸染料沒有混合均勻或濃度不足，應(yīng)重新配制凝膠或核酸染料溶液。

          

   1. 1.4檢測(cè)方法的局限性

       

   2. 基于已知序列信息的分型方法可能檢測(cè)不到新的等位基因，或者無法與已知等位基因相區(qū)別，為避免漏檢新的等位基因，當(dāng)使用PCR-SSP方法時(shí),可采用多種引物，以提高檢測(cè)到新等位基因的可能性。
8. -序列特異性寡核苷酸雜交（polymerase chain reaction-sequence specificoligonucleotide，PCR-SSO）方法

    

9. 2.1基本原理

    

PCR-SSO方法首先是對(duì)HLA的多態(tài)性區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，然后根據(jù) 堿基配對(duì) 原則使用特異性探針進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交信號(hào)判斷結(jié)果。基于PCR-SSO技術(shù)的HLA分型方法主要包括正相SSO方法和反相SSO方法兩種。PCR-SSO技術(shù)具有 靈敏度 高、特異性強(qiáng)、加樣量少的特點(diǎn)。

2000年后基于流式熒光檢測(cè)儀Luminex平臺(tái)的PCR-SSO基因分型檢測(cè)系統(tǒng)開發(fā)成功，它利用 傳統(tǒng) PCR-SSO的原理，首先對(duì)樣本的HLA多態(tài)性區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)解鏈后與 包被 在微珠上的特異性 探 針雜交結(jié)合，通過Luminex流式熒光檢測(cè)儀檢測(cè)，確定HLA分型結(jié)果。該系統(tǒng)是 整合 了熒光編碼微珠、激光檢測(cè)、應(yīng)用流體力學(xué)、高速數(shù)字信號(hào)和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法等多項(xiàng)技術(shù)的高通量檢測(cè)平臺(tái)。7.2主要針對(duì)Luminex平臺(tái)的PCR-SSO HLA基因分型檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行說明和要求。

1. 1. 2.2必需的設(shè)備與耗材（包括但不限于）

       

   2. 96孔PCR板、96孔雜交板、96孔讀取板、專用貼膜，單通道移液器、多道移液器，96孔PCR儀、Luminex分析儀，平板離心機(jī)，電泳系統(tǒng)及成像系統(tǒng)。
2. 2.3PCR引物和雜交探針的設(shè)計(jì)

    

3. 2.3.1PCR擴(kuò)增引物一般至少針對(duì) HLA Ⅰ類基因（HLA-A, HLA-B,HLA-C）的 2號(hào)外顯子和 3號(hào)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，至少針對(duì) HLA Ⅱ類基因（HLA-DRB1，HLA-DQB1）的 2號(hào)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。

    

4. PCR-SSO法的 HLA基因分型技術(shù)的關(guān)鍵是正確地設(shè)計(jì)特異性雜交探針，該探針序列應(yīng)與所檢測(cè)的 HLA等位基因序列相匹配。

    

5. 2.3.3PCR引物應(yīng)于-20℃保存,包被探針的微珠應(yīng)避免反復(fù)凍融、劇烈震蕩，按廠家說明書要求條件保存。

    

6. 2.4結(jié)果分析及問題解決方法

    

   1. 2.4.1總述

       

   2. 對(duì)于每個(gè)PCR-SSO反應(yīng)，如果內(nèi)對(duì)照雜交信號(hào)達(dá)到閾值，可認(rèn)為反應(yīng)有效；如內(nèi)對(duì)照和特異等位基因雜交信號(hào)均未達(dá)到閾值，可認(rèn)為反應(yīng)失??；如內(nèi)對(duì)照雜交信號(hào)未達(dá)到閾值，即使特異等位基因雜交信號(hào)達(dá)到閾值，也認(rèn)為反應(yīng)失敗。
7. 2.4.2常見問題可能原因及解決方法

    

   1. 2.4.2.1擴(kuò)增反應(yīng)失?。娪撅@示無擴(kuò)增條帶）

       

      1. PCR儀的問題，用確認(rèn)的 DNA樣本對(duì)檢測(cè)試劑和 PCR儀進(jìn)行驗(yàn)證；

          

      2. b) DNA的質(zhì)量不符合要求，DNA濃度太低，可以適當(dāng)增加 DNA模板量，或增加 Taq酶量或兩者同時(shí)增加，如果凝膠成像顯示 DNA條帶正常，可能是 DNA純度差的原因，需要重新提取 DNA。

          

   1. 2.4.2.2微珠讀取數(shù)量未達(dá)到閾值

       

      1. a) Luminex儀器進(jìn)樣針堵塞，應(yīng)對(duì)儀器進(jìn)行檢修；

          

      2. b) 微珠混合不均勻，應(yīng)確保每一步驟嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行；

          

      3. c) 微珠的保存條件不正確，應(yīng)按廠家說明書要求進(jìn)行保存。

          

   1. 2.4.2.3雜交熒光信號(hào)出現(xiàn)假陰性或未達(dá)到閾值

       

      1. a) PCR反應(yīng)擴(kuò)增失敗或擴(kuò)增反應(yīng)弱，應(yīng)參照 7.2.4.2.1的解釋；

          

      2. Luminex儀器的問題，用確認(rèn)的 DNA樣本對(duì)檢測(cè)試劑和 Luminex儀器進(jìn)行驗(yàn)證；

          

      3. c) 雜交試劑的保存、配制以及雜交后洗滌條件不當(dāng)，應(yīng)確保每一步驟嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

          

   1. 2.4.2.4雜交熒光信號(hào)出現(xiàn)假陽(yáng)性

       

      1. a) DNA純度和濃度沒有達(dá)到要求，應(yīng)參照 7.2.4.2.1 b)的解釋；

          

      2. b) PCR擴(kuò)增反應(yīng)中 Taq酶過量，應(yīng)確保每一步驟嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行；

          

      3. Luminex儀器的問題，用確認(rèn)的 DNA樣本對(duì)檢測(cè)試劑和 Luminex儀器進(jìn)行驗(yàn)證；

          

      4. d) 雜交過程中未充分混勻、孵育時(shí)間過長(zhǎng)、熒光染料過量、洗板后孔內(nèi)上清殘留過多，應(yīng)確保每一步驟嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

          

   1. 2.5檢測(cè)方法的局限性

       

   2. 基于已知序列信息的分型方法可能檢測(cè)不到新的等位基因，或者無法與已知等位基因相區(qū)別，為避免漏檢新的等位基因，當(dāng)使用PCR-SSO方法時(shí),可以加大探針的種類和數(shù)量，以提高檢測(cè)到潛在的新的等位基因的可能性。
8. 3基于直接測(cè)序法（sequence-based typing,SBT）

    

   1. 3.1基本原理

       

   2. 基于SBT的HLA基因分型檢測(cè)是對(duì)DNA序列進(jìn)行直接測(cè)序，通過與國(guó)際HLA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，獲得HLA等位基因型別的分析方法。任何DNA直接序列測(cè)定的方法均可用于HLA基因分型檢測(cè)，該方法是最高效的HLA基因分型方法，可正確確定新的HLA等位基因。
   1. 3.2必需的設(shè)備（包括但不限于）

       

   2. PCR儀、DNA測(cè)序儀、HLA基因分型軟件、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。
9. 3.3PCR擴(kuò)增引物及測(cè)序引物的設(shè)計(jì)

    

10. 3.3.1PCR擴(kuò)增引物一般針對(duì) HLA Ⅰ類基因和 HLA Ⅱ類基因的各外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，宜使用商業(yè)試劑盒。

     

11. 3.3.2測(cè)序引物一般根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的區(qū)域決定，可使用商業(yè)試劑盒。

     

12. 3.3.3引物和測(cè)序試劑應(yīng)分裝保存。

     

13. 3.4結(jié)果分析及問題的解決方法

     

    1. 3.4.1總述

        

    2. 以Sanger雙脫氧鏈終止法為代表的第一代測(cè)序方法應(yīng)用較為廣泛，本條內(nèi)容主要針對(duì)采用第一代測(cè)序技術(shù)的HLA基因分型檢測(cè)方法進(jìn)行說明和要求。
14. 3.4.2常見問題可能原因及解決方法

     

    1. 3.4.2.1無序列峰圖信號(hào)

        

       1. a) 測(cè)序模板未能有效擴(kuò)增，應(yīng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，確定是否有足量特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，如擴(kuò)增產(chǎn)物存在問題，應(yīng)重新擴(kuò)增；

           

       2. b) 測(cè)序引物選擇存在問題，應(yīng)核對(duì)加入引物的種類及加入量是否正確；

           

       3. c) 測(cè)序試劑配制、保存存在問題，每一步驟應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

           

    1. 3.4.2.2測(cè)序背景信號(hào)高

        

       1. a) 測(cè)序模板加入量沒有達(dá)到要求，應(yīng)重新調(diào)整測(cè)序模板加入量；

           

       2. b) 測(cè)序模板純度（擴(kuò)增條帶特異性差或 PCR抑制劑過多）沒有達(dá)到要求，應(yīng)重新純化和擴(kuò)增測(cè)序模板。

           

    1. 3.4.2.3雜峰信號(hào)過多

        

       1. PCR反應(yīng)液污染，應(yīng)重新進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)；

           

       2. b) 測(cè)序模板加入量偏少，測(cè)序信號(hào)值偏低，應(yīng)調(diào)整測(cè)序模板加入量；

           

       3. c) 測(cè)序引物特異性或延伸效率較差，應(yīng)重新設(shè)計(jì)或合成測(cè)序引物；

           

       4. d) 存在堿基插入或缺失區(qū)段，應(yīng)進(jìn)行等位基因特異性擴(kuò)增測(cè)序或克隆測(cè)序鑒定；

           

       5. e) GC含量過高，測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)效率過低，應(yīng)調(diào)整測(cè)序 PCR程序或調(diào)整測(cè)序反應(yīng)體系。

           

15. 3.5檢測(cè)方法的局限性

     

由于HLA具有高度多態(tài)性，在分型時(shí)測(cè)序區(qū)域有時(shí)會(huì)出現(xiàn)序列組合形式上有效相同的情況，這種情況既可能是由于兩個(gè)或多個(gè)等位基因在所檢測(cè)區(qū)域序列一致（兩者差異在所檢測(cè)區(qū)域之外），又可能是由于該測(cè)序區(qū)域存在相同的等位基因組合，此時(shí)應(yīng)擴(kuò)大檢測(cè)區(qū)域或采用等位基因選擇性擴(kuò)增的方法進(jìn)行

分型。

8質(zhì)量控制

1. 1. 1原則和目的

       

   2. 檢測(cè)結(jié)果的正確性和高效性依賴于實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制，質(zhì)量控制包括對(duì)試劑、人員技能和設(shè)備儀器性能的質(zhì)量控制。試劑包括檢測(cè)用的任何化學(xué)或生物制品，對(duì)試劑的正確標(biāo)記、保存、配制和使用都非常重要，試劑使用不當(dāng)可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的高效性甚至對(duì)檢測(cè)人員的健康和安全構(gòu)成威脅。對(duì)人員的培訓(xùn)、儀器的校準(zhǔn)、維護(hù)維修也是質(zhì)量控制的組成部分。實(shí)驗(yàn)室開展的檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)至少參加一項(xiàng)能力驗(yàn)證/室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（Proficiency Testing/External Quality Assessment, PT/EQA）項(xiàng)目，如果沒有PT/EQA組織機(jī)構(gòu)能夠提供對(duì)該項(xiàng)目的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)與其它實(shí)驗(yàn)室建立平行檢測(cè)比較，至少每6個(gè)月一次。
2. 2人員檢測(cè)能力考核評(píng)估

    

3. 2.1實(shí)驗(yàn)室主任、技術(shù)主管及檢測(cè)人員應(yīng)參與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目相關(guān)的繼續(xù)教育。

    

4. 2.2實(shí)驗(yàn)室主任和技術(shù)主管應(yīng)建立檢測(cè)人員技能評(píng)估的計(jì)劃和程序文件,至少每年對(duì)相關(guān)人員的技能進(jìn)行一次評(píng)估并記錄。

    

5. 2.3實(shí)驗(yàn)室主任和技術(shù)主管應(yīng)對(duì)檢測(cè)人員的檢測(cè)能力進(jìn)行考核并記錄。第一年至少考核兩次，一年后每年至少考核一次，每當(dāng)檢測(cè)方法或者儀器發(fā)生變更時(shí)考核一次，離崗 6個(gè)月及以上人員再上崗前應(yīng)增加考核一次。

    

6. 2.4實(shí)驗(yàn)室主任和技術(shù)主管應(yīng)每年至少一次向檢測(cè)人員發(fā)放相應(yīng)的特定質(zhì)控物作為盲樣，以驗(yàn)證檢測(cè)人員對(duì)相應(yīng)質(zhì)控物的檢測(cè)能力。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保留每位檢測(cè)人員的驗(yàn)證結(jié)果至少兩年。

    

   1. 2.5檢測(cè)能力考核評(píng)估記錄應(yīng)包括以下內(nèi)容：

       

      1. a) 常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目操作的規(guī)范性，包括樣本的準(zhǔn)備、處理和檢測(cè)；

          

      2. b) 實(shí)驗(yàn)記錄的完整性、真實(shí)性；

          

      3. c) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性；

          

      4. d) 儀器保養(yǎng)和操作的正確性；

          

      5. e) 質(zhì)控記錄、PT/EQA結(jié)果、儀器維護(hù)記錄的完整性；

          

      6. f) 通過已檢測(cè)樣本、室內(nèi)盲樣、室間質(zhì)評(píng)樣本評(píng)估其檢測(cè)能力；

          

      7. g) 綜合評(píng)估其解決問題的能力。

          

7. 3試劑質(zhì)量控制

    

8. 3.1試劑標(biāo)記

    

9. 3.2供貨商評(píng)價(jià)

    

10. 3.2.1建立實(shí)驗(yàn)室承認(rèn)的供貨商評(píng)價(jià)系統(tǒng)，供貨商資格滿足實(shí)驗(yàn)檢測(cè)要求。

     

11. 3.2.2建立合同審計(jì)制度。

     

12. 3.2.3建立供貨商所提供試劑的質(zhì)量證明和質(zhì)控報(bào)告記錄檔案。

     

13. 3.3試劑管理

     

14. 3.3.1建立實(shí)驗(yàn)室常用試劑清單，包括但不限于以下內(nèi)容：試劑名稱/化學(xué)式、毒性、制造商和貨號(hào)、制備要求、儲(chǔ)存要求。

     

15. 3.3.2建立實(shí)驗(yàn)室試劑使用記錄/質(zhì)控記錄，包括但不限于以下內(nèi)容：試劑名稱、批號(hào)、接收日期、使用期限、配制日期或開啟日期、配制人或開啟人簽名。

     

16. 3.3.3所有過失效期的試劑應(yīng)廢棄。

     

17. 3.3.4商業(yè)試劑盒不同批號(hào)間的試劑不應(yīng)混用，除非制造商經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)檢測(cè)結(jié)果無影響。

     

18. 3.3.5建立實(shí)驗(yàn)室試劑庫(kù)存清單，以高效檢測(cè)期間試劑的供應(yīng)，試劑庫(kù)存清單應(yīng)包括但不限于以下內(nèi)容：上一批訂購(gòu)量、訂貨周期、最小庫(kù)存量。

     

19. 3.4試劑性能記錄

     

20. 3.4.1每種試劑在用于檢測(cè)前，都應(yīng)滿足其最低標(biāo)準(zhǔn)要求。

     

21. 3.4.2每批新試劑用于檢測(cè)前，應(yīng)檢測(cè)其性能指標(biāo)，應(yīng)與現(xiàn)用試劑具有同等質(zhì)量、達(dá)到同樣性能標(biāo)準(zhǔn)。

     

22. 3.4.3當(dāng)試劑性能指標(biāo)超出可接受誤差范圍時(shí)，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)并上報(bào)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)主管。

     

    1. 3.5試劑質(zhì)控的程序

        

    2. 應(yīng)制定試劑質(zhì)控程序，詳細(xì)說明質(zhì)控過程，質(zhì)控記錄應(yīng)存檔。該記錄內(nèi)容應(yīng)包括試劑性能的可接受范圍和與歷史數(shù)據(jù)的比對(duì)。對(duì)于HLA基因分型，試劑質(zhì)控主要針對(duì)引物和探針的特異性。
    1. 3.6試劑不能使用的原則

        

    2. 新批號(hào)試劑檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不符，不同批號(hào)試劑平行檢測(cè)中新批號(hào)試劑結(jié)果偏離較大，試劑造成質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤，試劑中發(fā)現(xiàn)有污染。
23. 3.7引物的質(zhì)量控制（SSP方法）

     

24. DNA陽(yáng)性質(zhì)控品檢測(cè) SSP引物陽(yáng)性反應(yīng)的特異性。若 SSP板第一孔是 DRB1*01特異的引物，則加入包含 DRB1*01的 DNA質(zhì)控品；SSP板的每一孔都應(yīng)加入相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性 DNA質(zhì)控品。質(zhì)控品可為已知分型的純合或雜合細(xì)胞株，也可使用已分型的患者或 PT/EQA樣本；陽(yáng)性板的每個(gè)反應(yīng)孔都應(yīng)出現(xiàn)正確的特異性條帶，對(duì)于多基因型 SSP特異性引物，應(yīng)用多個(gè)相對(duì)應(yīng)的 DNA陽(yáng)性質(zhì)控品進(jìn)行評(píng)價(jià)。

     

25. DNA質(zhì)控品用于評(píng)估引物的陰性特異性。用兩個(gè)以上陰性 DNA質(zhì)控品對(duì) SSP板做檢測(cè)，陰性反應(yīng)孔應(yīng)只有內(nèi)參條帶出現(xiàn)；陰性質(zhì)控品應(yīng)選擇與引物特異性非常接近的 DNA質(zhì)控品，特別應(yīng)針對(duì)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的 SSP引物。

     

26. 3.7.3為整體評(píng)估 SSP全套引物的特異性，應(yīng)對(duì) DNA質(zhì)控品做全套引物的完整分型，觀察、確認(rèn)非特異性條帶和/或交叉反應(yīng)出現(xiàn)。

     

27. 3.7.4應(yīng)高效所用試劑質(zhì)量滿足檢測(cè)要求。

     

28. 3.8探針的質(zhì)量控制

     

29. 3.8.1SSO探針標(biāo)記的質(zhì)量控制

     

30. 3.8.1.1每條探針標(biāo)記后，需用 DNA質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，高效其敏感性和特異性。

     

31. 3.8.1.2檢測(cè)結(jié)果應(yīng)記錄在“探針質(zhì)控工作表”中。

     

32. 3.8.1.3推薦每次進(jìn)行 SSO分型時(shí)，同時(shí)包含 DNA質(zhì)控品。

     

33. SSO質(zhì)量控制

     

34. 3.8.2.1實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的反向 SSO，新批號(hào)的試劑應(yīng)通過有效 DNA質(zhì)控品的確認(rèn)，以高效每條探針的特異性。

     

35. 3.8.2.2商業(yè)試劑盒用于患者樣本檢測(cè)前，應(yīng)先用 DNA質(zhì)控品進(jìn)行評(píng)價(jià)。試劑使用過程中，應(yīng)定期用 DNA質(zhì)控品監(jiān)測(cè)探針的特異性。

     

36. 4設(shè)備的維護(hù)和校準(zhǔn)

     

37. PCR儀、孵育箱、冰箱和水浴箱的溫度，用于監(jiān)控的溫度計(jì)使用前應(yīng)進(jìn)行校準(zhǔn)。

     

38. 4.2PCR儀反應(yīng)孔的溫度正確性和一致性應(yīng)進(jìn)行監(jiān)控，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)定孔間實(shí)際溫度偏差和預(yù)期溫度偏差的可接受范圍。

     

39. 4.3移液器應(yīng)至少每年校準(zhǔn)一次，移液器的使用和清潔應(yīng)參照制造商的說明書。

     

40. 4.4測(cè)序儀等大型設(shè)備應(yīng)制定日常維護(hù)的操作程序、日常維護(hù)檢查時(shí)間表，并記錄維護(hù)檢查結(jié)果，保存在維護(hù)手冊(cè)中。

     

41. 4.5應(yīng)制定設(shè)備維護(hù)檢查結(jié)果的可接受范圍，當(dāng)結(jié)果超出可接受范圍時(shí)采取糾正措施，包括但不限于以下：記錄故障發(fā)現(xiàn)過程、記錄儀器維修過程、將詳細(xì)故障告知相關(guān)人員、啟用備用程序和備用儀器。

     

42. 4.6設(shè)備故障維修后應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證滿足檢測(cè)性能后，方可重新投入使用，并追溯評(píng)估故障前最后一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。

     

43. 5PT/EQA項(xiàng)目

     

44. 5.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參加由授權(quán)機(jī)構(gòu)組織的 PT/EQA項(xiàng)目。

     

45. PT/EQA結(jié)果回報(bào)最后期限前，實(shí)驗(yàn)室不應(yīng)以任何形式與其他實(shí)驗(yàn)室交流 PT/EQA樣本的檢測(cè)結(jié)果。如實(shí)驗(yàn)室主任管轄范圍內(nèi)多個(gè)分支實(shí)驗(yàn)室同時(shí)參與 PT/EQA項(xiàng)目，應(yīng)避免各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的交流。

     

46. 5.3實(shí)驗(yàn)室不應(yīng)將本實(shí)驗(yàn)室的 PT/EQA樣本送至其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，也不應(yīng)將檢測(cè)結(jié)果傳至其他實(shí)驗(yàn)室。

     

47. 5.4以對(duì)待常規(guī)臨床樣本的方式對(duì)待 PT/EQA樣本，所有檢測(cè)人員應(yīng)參與 PT/EQA樣本的檢測(cè)。

     

48. 5.5實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì) PT/EQA樣本的接收、保存、準(zhǔn)備、處理、操作和檢測(cè)過程中的每一步驟及結(jié)果報(bào)告進(jìn)行記錄并歸檔。與 PT/EQA有關(guān)的各項(xiàng)記錄的復(fù)印件至少在實(shí)驗(yàn)室保存兩年，其中包括 PT/EQA樣本檢測(cè)結(jié)果回報(bào)表的復(fù)印件、所有與 PT/EQA組織單位就樣本檢測(cè)的交流記錄、實(shí)驗(yàn)室主任或技術(shù)主管對(duì)每次的 PT/EQA樣本檢測(cè)或相關(guān)整改措施的審核報(bào)告的復(fù)印件。

     

49. PT/EQA不合格時(shí)，應(yīng)調(diào)查和分析引起錯(cuò)誤的原因，實(shí)施相應(yīng)的整改措施并同時(shí)記錄歸檔。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)緊急采取整改措施，確認(rèn)同類錯(cuò)誤未發(fā)生在臨床樣本檢測(cè)報(bào)告中。

     

50. 6DNA污染的控制

     

    1. 6.1原則和目的

        

    2. 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以將DNA片段擴(kuò)增到百萬倍甚至更多，但由于擴(kuò)增產(chǎn)物可以在后續(xù)PCR循環(huán)里再次被擴(kuò)增，因而使用PCR技術(shù)的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)就是擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)室污染。PCR實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量高效體系的一個(gè)重要部分就是監(jiān)控DNA污染。DNA污染可來自基因組DNA和擴(kuò)增產(chǎn)物，均可導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果，從而造成實(shí)驗(yàn)報(bào)告錯(cuò)誤。因此，HLA基因分型實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行DNA污染的常規(guī)監(jiān)測(cè)。
51. 6.2實(shí)驗(yàn)室布局和工作流程

     

檢測(cè)試劑應(yīng)按5.3中的要求進(jìn)行標(biāo)記。

實(shí)驗(yàn)室試劑配制、樣本制備、擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)應(yīng)分別在3～4個(gè)相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，可根據(jù)方法適當(dāng)調(diào)整區(qū)域數(shù)量。應(yīng)符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》的要求。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立單向工作流程，使用單向工作流程可減少污染的發(fā)生。

1. 1. 6.3實(shí)驗(yàn)服和手套

       

   2. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況，宜在試劑配制區(qū)、樣本準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增和檢測(cè)區(qū)分別配備專用實(shí)驗(yàn)服，出入各區(qū)時(shí)更換。為減少潔凈區(qū)污染，每次進(jìn)入試劑配制區(qū)時(shí)應(yīng)配戴或更換新手套。
2. 6.4移液器

    

   1. 6.5試劑

       

   2. 所有用于核酸擴(kuò)增的試劑應(yīng)配制后分裝，并與樣本或擴(kuò)增產(chǎn)物分開存放，以減少取樣次數(shù)，降低污染風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)記錄試劑批號(hào)，一旦發(fā)生污染，可以追溯污染源。
   1. 6.6加樣

       

   2. 在開蓋前宜將反應(yīng)管快速離心，小心開蓋以防氣溶膠形成。應(yīng)在反應(yīng)管中先加入非樣本反應(yīng)組分（如dNTPs、引物、緩沖液、酶），再加入樣本，每加完一個(gè)樣本要蓋好蓋后再加下一個(gè)樣本。
3. 7對(duì)照反應(yīng)

    

4. 7.1每次檢測(cè)應(yīng)同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

    

5. 7.2陽(yáng)性對(duì)照是包含已知的 DNA模板，其目的為證明擴(kuò)增反應(yīng)體系可正常工作。

    

6. 7.3陰性對(duì)照即為反應(yīng)物空白對(duì)照，該對(duì)照包含正常反應(yīng)除模板 DNA外的所有試劑，其目的是檢測(cè)有無模板 DNA的污染。

    

7. 8擴(kuò)增產(chǎn)物的滅活方法

    

8. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的滅活方法

    

9. 8.1.1酶滅活法：在擴(kuò)增時(shí)用 dUTP代替 dTTP參與 PCR反應(yīng)，生成 dU化的擴(kuò)增產(chǎn)物，這種產(chǎn)物由于存在“非自然”狀態(tài)下的堿基而與靶 DNA相區(qū)別。細(xì)菌的尿嘧啶糖苷酶（UNG）加入反應(yīng)混合物，上次擴(kuò)增的 dU化的 PCR產(chǎn)物就會(huì)被 UNG降解，不會(huì)作為下一次擴(kuò)增的模板。

    

10. 8.1.2局部滅活方案：可使用含氯漂白劑（例如次氯酸鈉）清潔工作臺(tái)面等，以清除殘留的 PCR產(chǎn)物或者其他污染源，用紫外燈照射工作臺(tái)面也是控制污染的有效措施。

     

    1. 8.2擴(kuò)增產(chǎn)物滅活方法的實(shí)施

        

    2. 確定擴(kuò)增產(chǎn)物滅活方法后應(yīng)建立相應(yīng)的驗(yàn)證方法。酶滅活法應(yīng)用稀釋的PCR產(chǎn)物人為“污染”反應(yīng)液，然后分析滅活效果，以評(píng)價(jià)滅活方法的有效性。如果實(shí)驗(yàn)室需要更換另一種滅活方法，應(yīng)在更換前對(duì)新方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，并證實(shí)新方法的有效性。
    1. 9擦拭檢測(cè)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室污染

        

    2. 開展HLA基因分型的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過常規(guī)擦拭檢測(cè)（wipe test）、陰性對(duì)照、開管對(duì)照等途徑來監(jiān)測(cè)DNA污染或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染。擦拭檢測(cè)用于檢查實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和臺(tái)面是否被DNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染，對(duì)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的區(qū)域需采取適當(dāng)?shù)恼拇胧?
11. 9.1擦拭檢測(cè)實(shí)施措施

     

12. 9.1.1用實(shí)驗(yàn)室最常見擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增試劑常規(guī)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增前區(qū)域的污染情況。

     

13. 9.1.2監(jiān)測(cè)潛在的污染，使用的方法應(yīng)達(dá)到常規(guī)檢測(cè)方法的靈敏度，且使用合適的引物。每次擴(kuò)增至少包括一個(gè)陰性對(duì)照和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。

     

14. 9.1.3每次擦拭檢測(cè)宜包括污染監(jiān)測(cè)反應(yīng)和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)。

     

15. 9.1.4如果檢測(cè)到 PCR抑制的存在，應(yīng)采取清潔措施排除 PCR抑制物的干擾，并重復(fù)檢測(cè)，確認(rèn)抑制物被有效清除。

     

16. 9.1.5如果檢測(cè)到污染的存在，應(yīng)采取清潔措施清除污染源，并重復(fù)檢測(cè)，確認(rèn)污染源被有效清除。

     

17. 9.2污染監(jiān)測(cè)體系的建立

     

18. 9.2.1針對(duì)Ⅰ類和Ⅱ類基因擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的非多態(tài)區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，此引物能檢測(cè)到所有的 PCR產(chǎn)物和基因組 DNA污染。

     

19. 9.2.2建立并確認(rèn) PCR方法的擦拭檢測(cè)步驟。

     

20. DNA或稀釋的 PCR產(chǎn)物（作為摻入樣本對(duì)照），應(yīng)確認(rèn)擦拭檢測(cè)引物對(duì)所用分型方法產(chǎn)生的 PCR產(chǎn)物是有效的，反應(yīng)液不含有干擾或抑制 Taq聚合酶活性的外來雜質(zhì)。

     

21. 9.2.4根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳有無 PCR產(chǎn)物，記錄“+”或“-”。

     

    1. 1總述

        

    2. 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)提供及時(shí)、正確、清晰、高效和客觀的檢測(cè)報(bào)告，檢測(cè)報(bào)告應(yīng)包括客戶的要求、檢測(cè)方法等內(nèi)容。在為內(nèi)部客戶或有書面協(xié)議的客戶檢測(cè)時(shí)可用簡(jiǎn)化的報(bào)告方式。檢測(cè)報(bào)告可用紙版或電子版形式發(fā)布。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確保檢測(cè)報(bào)告的保密性。
    1. 2檢測(cè)報(bào)告的內(nèi)容和格式

        

    2. 檢測(cè)報(bào)告應(yīng)包含但不局限于以下內(nèi)容：患者姓名、性別、出生日期、標(biāo)本采集日期、標(biāo)本號(hào)或病例號(hào)、樣本實(shí)驗(yàn)室編碼和唯一標(biāo)識(shí)、檢測(cè)方法的簡(jiǎn)單描述、檢測(cè)結(jié)果及解釋、報(bào)告日期、報(bào)告單編號(hào)、實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或其他授權(quán)人員的簽名、實(shí)驗(yàn)室的名稱、地址和電話，檢測(cè)報(bào)告應(yīng)標(biāo)有頁(yè)碼和總頁(yè)數(shù)。報(bào)告內(nèi)容可根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)整。
22. 2.1檢測(cè)報(bào)告的格式

     

23. 2.1.1檢測(cè)報(bào)告的格式應(yīng)適用于各種檢測(cè)類型，減少產(chǎn)生誤解或誤用的可能性。應(yīng)注意檢測(cè)報(bào)告的排版，使檢測(cè)數(shù)據(jù)的表達(dá)方式易于理解。檢測(cè)報(bào)告的表頭應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。

     

24. 2.1.2報(bào)告格式的設(shè)計(jì)應(yīng)考慮所有可能出現(xiàn)的檢測(cè)結(jié)果，高效與相關(guān)指南或規(guī)定的要求相一致。檢測(cè)報(bào)告的格式應(yīng)包括但不局限于以下因素：關(guān)鍵信息應(yīng)突出顯示或重復(fù)描述、表達(dá)方式清晰（如提供范圍、閾值）、用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估計(jì)算的信息、免責(zé)聲明或?qū)z測(cè)局限性的說明（如分析有效性、臨床有效性、非親子關(guān)系等）。

     

25. 2.2檢測(cè)報(bào)告的解釋

     

26. 2.2.1檢測(cè)報(bào)告中應(yīng)給出檢測(cè)結(jié)果的解釋說明。

     

27. 2.2.2宜采用 IPD-IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(kù)解釋數(shù)據(jù)。

     

28. 2.2.3檢測(cè)結(jié)果的解釋應(yīng)清晰、易于理解，便于非 HLA專業(yè)的醫(yī)生閱讀。

     

29. 2.2.4對(duì)檢測(cè)報(bào)告中未予解釋而客戶要求解釋的部分，應(yīng)由臨床咨詢醫(yī)師或其他實(shí)驗(yàn)室授權(quán)人員做出口頭或書面的解釋。

     

30. 3檢測(cè)報(bào)告的發(fā)放

     

31. 3.1檢測(cè)報(bào)告應(yīng)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室主任或技術(shù)主管或其他授權(quán)人的審核和承認(rèn)后發(fā)放。

     

32. 3.2實(shí)驗(yàn)室提供的檢測(cè)報(bào)告可以是紙版或電子版形式，但只能將檢測(cè)報(bào)告發(fā)放給檢測(cè)申請(qǐng)者或其指定人員。

     

33. 3.3當(dāng)用傳真的形式發(fā)放報(bào)告時(shí)應(yīng)確保傳真件與Ö#21407;始紙版報(bào)告內(nèi)容一致。傳真封面的收件人應(yīng)為申請(qǐng)者或其指定人員。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采用封面提示注明傳真內(nèi)容包含保密信息，受法律保護(hù)。

     

34. 3.4通過電話發(fā)放報(bào)告不能高效信息的隱私保護(hù)，應(yīng)限制或禁止使用電話方式傳遞信息。

     

    1. 4檢測(cè)報(bào)告的修改

        

    2. 對(duì)已發(fā)放的檢測(cè)報(bào)告進(jìn)行實(shí)質(zhì)性修改，應(yīng)僅采用追加文件或資料更換的形式，并包括如下說明：“對(duì)某某檢測(cè)報(bào)告的補(bǔ)充，報(bào)告單編號(hào)等”，或其他等效的文字形式。如要發(fā)布全新的檢測(cè)報(bào)告，應(yīng)標(biāo)注唯一性標(biāo)識(shí)，并注明所替代的原件。
35. 5檢測(cè)報(bào)告的保存

     

36. 5.1每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)定其檢測(cè)報(bào)告的保存時(shí)間、文件目錄和文件類型。

     

37. 5.2所有患者的檢測(cè)報(bào)告，應(yīng)易于通過患者唯一性標(biāo)識(shí)（如實(shí)驗(yàn)室檢索號(hào)碼或病例號(hào)）檢索。

     

38. 5.3所有檢測(cè)報(bào)告均應(yīng)妥善保管，并高效資料的保密性和完整性。

     

39. 5.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保留檢測(cè)報(bào)告至少 5年，與家系有關(guān)的遺傳檢測(cè)的重要記錄通常至少應(yīng)保存一代（20年）。

     

試劑配制區(qū)、樣本準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增和檢測(cè)區(qū)應(yīng)分別配備專用移液器。應(yīng)使用帶濾芯吸頭以防移液器管腔被氣溶膠污染。所有移液器應(yīng)定期清洗。

9檢測(cè)報(bào)告10記錄管理

1. 1. 1總述

       

   2. 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立收集、索引、存取、保存、維護(hù)和清理檢測(cè)記錄的程序。檢測(cè)記錄可有電子版和紙版等方式，其索引清晰，易于查詢，應(yīng)存放在可防止損壞、變質(zhì)、丟失的設(shè)施中。所有記錄應(yīng)安全保護(hù)并采取保密措施，應(yīng)規(guī)定記錄的保存期限。記錄應(yīng)在授權(quán)后才允許公布。
2. 2電子記錄的管理

    

3. 2.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，包含適用的軟件和硬件，用于記錄所有樣本的檢測(cè)信息。檢測(cè)信息包括檢測(cè)申請(qǐng)、檢測(cè)樣本的唯一標(biāo)識(shí)、樣本來源、接收日期和時(shí)間、檢測(cè)數(shù)據(jù)、結(jié)果、檢測(cè)方法、檢測(cè)操作人員等。

    

4. 2.2實(shí)驗(yàn)室的電子記錄應(yīng)備份，但不能儲(chǔ)存在同一計(jì)算機(jī)或光盤上，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有訪問保護(hù)措施，防止未經(jīng)授權(quán)的侵入或修改。

    

5. 2.3實(shí)驗(yàn)室計(jì)算機(jī)系統(tǒng)只能限于授權(quán)人使用，以高效數(shù)據(jù)的完整性、安全性和高效性。

    

6. 2.4實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有電子記錄備份的操作程序，在意外事件發(fā)生后可啟動(dòng)電子數(shù)據(jù)恢復(fù)。

    

7. 2.5記錄中出現(xiàn)錯(cuò)誤時(shí)，不可直接刪除，應(yīng)在相應(yīng)的位置寫出正確值，以避免原始數(shù)據(jù)的丟失或改動(dòng)，對(duì)記錄的所有改動(dòng)應(yīng)備注改動(dòng)人的簽名或簽名縮寫及日期。

    

8. 2.6實(shí)驗(yàn)室電子記錄應(yīng)保存 5年以上。

    

9. 3紙版記錄的管理

    

10. 3.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按規(guī)定時(shí)限保存紙版記錄。

     

11. 3.2紙版記錄內(nèi)容可包含檢測(cè)操作步驟、檢測(cè)樣本來源、唯一標(biāo)識(shí)、檢測(cè)人員、檢測(cè)結(jié)果、檢測(cè)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)室主管簽字等。

     

12. 3.3記錄中出現(xiàn)錯(cuò)誤時(shí)不可擦涂，應(yīng)在相應(yīng)的位置寫出正確值，以避免原始數(shù)據(jù)的丟失或改動(dòng)，對(duì)記錄的所有改動(dòng)應(yīng)備注改動(dòng)人的簽名或簽名縮寫及日期。

     

    1. 3.4紙版記錄應(yīng)保存 5年以上。

        

    2. 11問題和糾正措施
13. 1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立管理體系和程序文件，明確相應(yīng)的責(zé)任，處理并記錄來自客戶和其他方面的投訴及問題，所有投訴均應(yīng)進(jìn)行調(diào)查并采取糾正措施。實(shí)驗(yàn)室管理體系或技術(shù)操作中的問題，可以通過內(nèi)部或外部的審核、管理評(píng)審、客戶的反饋等途徑進(jìn)行解決。

     

    1. 2當(dāng)檢測(cè)體系未能滿足實(shí)驗(yàn)室規(guī)定的性能指標(biāo)時(shí)，應(yīng)記錄所有采取的糾正措施：

        

       1. a)儀器或方法處于操作參數(shù)或性能指標(biāo)以外；

           

       2. b)檢測(cè)結(jié)果在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)體系可報(bào)告結(jié)果范圍之外；

           

       3. c)實(shí)驗(yàn)室確定的檢測(cè)程序的參考值（正常值）對(duì)檢測(cè)對(duì)象人群不適用；

           

       4. d)質(zhì)控品和對(duì)照品的結(jié)果不符合實(shí)驗(yàn)室的可接受標(biāo)準(zhǔn)；

           

       5. e)試劑、樣本的保存不符合規(guī)定。

           

14. 3糾正措施應(yīng)便于獲得和執(zhí)行，以確保檢測(cè)結(jié)果和報(bào)告的正確可信。

     

15. 4應(yīng)記錄、調(diào)查、糾正在患者樣本或 PT/EQA檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)的任何問題，以防再次發(fā)生。

     

16. 5應(yīng)記錄、調(diào)查、糾正任何由實(shí)驗(yàn)室空間、人員安全條件不適所致的意外事件，以防再次發(fā)生。

     

17. 6糾正措施應(yīng)從調(diào)查問題的根本原因開始，原因分析是糾正措施的關(guān)鍵，應(yīng)仔細(xì)分析問題發(fā)生的所有潛在原因，包括但不限于：客戶要求、樣品類型、樣品規(guī)格、檢測(cè)方法和程序、人員的技能和培訓(xùn)、耗材、設(shè)備及其校準(zhǔn)等。

     

18. 7實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)糾正措施的結(jié)果進(jìn)行監(jiān)控，確認(rèn)檢測(cè)體系能夠恢復(fù)到正常工作狀態(tài)，以確定所采取的糾正措施有效。

     

19. 8對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)體系出現(xiàn)的任何問題，糾正措施被確認(rèn)有效前，不應(yīng)對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)或發(fā)放報(bào)告，以避免錯(cuò)誤的發(fā)生。

     

20. 9所有發(fā)現(xiàn)的問題、原因、解決方法、糾正措施和糾正后的結(jié)果均應(yīng)記錄并存檔。

     

21. 10當(dāng)檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏離或?qū)?shí)驗(yàn)室的管理制度和程序產(chǎn)生懷疑時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡快對(duì)相應(yīng)程序進(jìn)行審核。審核常在糾正措施實(shí)施后進(jìn)行，以確定糾正措施的有效性。

     

22. 11檢測(cè)體系出現(xiàn)錯(cuò)誤的潛在原因和所需改進(jìn)之處均應(yīng)記錄，無論是技術(shù)方面還是管理體系方面，均應(yīng)制定預(yù)防措施以減少類似錯(cuò)誤的發(fā)生。

     

A

A

附錄 A （規(guī)范性） 擦拭檢測(cè)污染的監(jiān)測(cè)體系

A.1擦拭檢測(cè)的主要試劑和材料

a) 引物；

b) 擦拭檢測(cè)

PCR反應(yīng)液；

c) 瓊脂糖凝膠；

d) 陽(yáng)性對(duì)照：基因組 DNA或稀釋的 PCR產(chǎn)物。如使用 PCR產(chǎn)物，將預(yù)先擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物梯度稀釋（1:1000到 1:1,000,000），檢測(cè)靈敏度須至少達(dá)到 1:10,000。選擇強(qiáng)陽(yáng)性條帶的最高稀釋度作為擦拭檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照品；

e) 其他：濾紙或者棉簽、鑷子、純水、異丙醇。

A.2擦拭檢測(cè)步驟

A.2.1檢測(cè)點(diǎn)的確定

DNA提取純化區(qū)、PCR試劑配制區(qū)、潔凈區(qū)實(shí)驗(yàn)臺(tái)、潔凈區(qū)地面及常用設(shè)備，均應(yīng)進(jìn)行擦拭檢測(cè)。

A.2.2擦拭步驟

a) 鑷子用異丙醇去污，并用超純水清洗，或者使用一次性無菌棉簽；

b) 用鑷子將直徑為

1.5cm的濾紙片在純水中浸濕，擦拭 10 cm ²的區(qū)域；

c) 將濾紙或棉簽放入 1.5mL離心管中，加 120 μL超純水，漩渦振蕩；

d) 56℃孵育

1 h，7000r/min離心 30s，4℃保存至使用。

A.2.3擦拭檢測(cè) PCR步驟

a) 將擦拭檢測(cè)

PCR反應(yīng)液加入 PCR管中，同樣將擦拭檢測(cè) PCR反應(yīng)液加入到在工作區(qū)開蓋至少一天的 PCR管中（作為空氣中氣溶膠污染的檢測(cè)，即開管陰性對(duì)照）；

b) 擴(kuò)增反應(yīng)包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照（無 DNA）、擦拭區(qū)待檢樣本、擦拭區(qū)摻入樣本的陽(yáng)性對(duì)照、開管陰性對(duì)照；

c) 用實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增程序擴(kuò)增擦拭樣本和對(duì)照；

d) PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并記錄結(jié)果；

e) 填寫實(shí)驗(yàn)室污染檢測(cè)結(jié)果記錄表，見表 1。

A.3污染區(qū)處理

表 1實(shí)驗(yàn)室污染檢測(cè)結(jié)果記錄表

應(yīng)首先用1 mol/L HCl或者10%漂白劑清洗污染區(qū)，然后用潔凈水有效清洗干凈。在繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)前，應(yīng)重復(fù)進(jìn)行擦拭檢測(cè)且結(jié)果為陰性（除了擴(kuò)增后區(qū)域），污染區(qū)處理后的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)記錄在案（見表2）。

表 2污染區(qū)處理后的檢測(cè)結(jié)果記錄表

A.4結(jié)果判斷

a) 在陽(yáng)性對(duì)照管中應(yīng)有 PCR產(chǎn)物出現(xiàn)，陰性對(duì)照管中應(yīng)無 PCR產(chǎn)物出現(xiàn)；

b) 每個(gè)擦拭檢測(cè)區(qū)域設(shè)置的“摻入樣本對(duì)照”均應(yīng)出現(xiàn) PCR產(chǎn)物，若該管無 PCR產(chǎn)物則提示 PCR反應(yīng)可能被樣本中的某些物質(zhì)所抑制，對(duì)應(yīng)的“非摻入樣本管”的結(jié)果無效；

c) 若“非摻入樣本管”中有 PCR產(chǎn)物出現(xiàn)，說明存在基因組 DNA或 PCR產(chǎn)物的污染，應(yīng)立即啟動(dòng)去污染措施，并重復(fù)進(jìn)行擦拭檢測(cè)以確認(rèn)污染去除成功；

d) 每次檢測(cè)均應(yīng)包括陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照可以是基因組 DNA或稀釋的 PCR產(chǎn)物，用以檢測(cè)引物是否有效；

e) 每次檢測(cè)均應(yīng)包括陰性對(duì)照和/或開管陰性對(duì)照。陰性對(duì)照內(nèi)不含已知來源的 DNA，用以檢測(cè)試劑污染和/或氣溶膠污染（開管陰性對(duì)照）。

參考文獻(xiàn)

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[3] ASHI. Standards for Accredited Laboratories, Approved by CMS. American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, 2019[4]《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》ISO/IEC 17025: 2017[5]《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力承認(rèn)準(zhǔn)則》ISO 15189: 2012, IDT[6]《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)）[7]《中華人民共和國(guó)人類遺傳資源管理?xiàng)l例》（中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院令〔2019〕第 717號(hào)）