【佳學基因檢測】前額高腭弓高囟門增大人中長眼距過寬肌張力減退還有癲癇是不是遺傳性DBP缺乏癥？

罕見病、遺傳病基因檢測導讀：

D-雙功能蛋白 (DBP) 缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳的過氧化物酶體脂肪酸氧化障礙?！度梭w生理功能及疾病表現(xiàn)的基因序列根源》指出雙功能是指人體內的單一的蛋白質如酶包含多個活性結構域，負責過氧化物酶體 β-氧化的連續(xù)步驟。對于D-雙功能蛋白（DBP）來說，DBP 催化超長鏈脂肪酸 (VLCFA) C26:0、支鏈脂肪酸（鸚鵡螺酸）和膽汁酸中間體的 β-氧化的第二步（水合）和第三步（脫氫） （二羥基膽甾烷酸 (DHCA) 和三羥基膽甾烷酸 (THCA)）。DBP 包含三個結構域，由 4 型 17-β 羥基類固醇脫氫酶 ( HSD17B4)編碼基因借助體內結構與功能蛋白的產生機制生成這一蛋白質。N 端短鏈乙醇脫氫酶結構域由外顯子 1-12 編碼，中心 2-烯酰輔酶 A 水合酶結構域由外顯子 12-21 編碼，C 端固醇載體蛋白 2 樣結構域（SCP-2L ) 由外顯子 21–24 編碼。DBP 是一種具有 79 kD 亞基的同型二聚體酶。進入過氧化物酶體后，蛋白質被切割，產生一個 35 kD 的脫氫酶單元和一個 45 kD 的水合酶加 SCP-2L 單元。

DBP 缺乏癥根據缺乏的活性分為三種亞型。DBP 缺乏癥 I 型是 2-烯醇-CoA 水合酶和 3-羥?；?CoA 脫氫酶活性的缺乏，DBP 缺乏癥 II 型是單獨的水合酶活性缺乏，DBP 缺乏癥 III 型是單獨的脫氫酶活性缺乏。佳學基因檢測對超過 100 名 DBP 缺乏患者的臨床和生化記錄進分分析，總結了所有三種生化亞型患者的臨床特征的相似性。幾乎所有患者都在出生后的先進個月內出現(xiàn)肌張力減退和癲癇發(fā)作，超過三分之二的患者還表現(xiàn)出 Zellweger 樣面部特征（即前額高、腭弓高、囟門增大、人中長、眼距過寬）。大多數(shù)患有 DBP 缺乏的嬰兒 (>80%) 在 2 歲之前死亡，通常死于呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥。生化檢測通常會發(fā)現(xiàn)血漿 C26:0、DHCA、THCA 以及鸚鵡螺酸及其前體植烷酸水平升高。只有少數(shù) (<2%) 的 DBP 缺陷患者會顯示正常的生化測試。因此，佳學基因強調在臨床上懷疑患者是過氧化物酶體功能紊亂的情況下需要采用培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞進行進一步基因解碼研究的重要性。

佳學基因檢測記錄了兩兄弟經過致病基因鑒定基因解碼確診患有 DBP 缺乏癥的臨床案例。雖然這些男孩表現(xiàn)出過氧化物酶體功能障礙的一些典型臨床特征（聽力障礙、小腦和感覺性共濟失調），但臨床檢查沒有出現(xiàn)血漿 VLCFA、鸚鵡螺酸和植烷酸或尿膽汁酸的明顯異常?；谕怙@子組測序的基因檢測對于檢測 DBP 水合酶和脫氫酶結構域中的復合雜合突變至關重要。針對 DBP 活性的進一步成纖維細胞酶測試證實水合酶和脫氫酶活性顯著降低但可檢測到。據此，佳學基因致病基因鑒定基因解碼認為患者有一種新型的 DPB 缺陷。學術界根據其獨特的臨床、生化和遺傳特征將其定義為 IV 型，從而擴大了與 DBP 功能改變相關的臨床表型譜。

患者病情介紹

患者 1

一名 16.5 歲的男孩在 3.5 歲時被診斷出語言表達遲緩和發(fā)音困難，這是由中度至重度感音神經性聽力障礙引起的。他的語言發(fā)展在助聽器的幫助下有效正?；Ｋ缙诘拇执蠛途氝\動發(fā)育正常；他小時候會滑冰和打曲棍球。他在普通課堂環(huán)境中的學業(yè)成績很好。11 歲時，他患上了隱匿的進行性步態(tài)共濟失調。他被發(fā)現(xiàn)有雙側高弓足和輕度槌狀趾足畸形、彌漫性反射消失和屈肌足底反應。注意到前間室肌肉非常輕度無力，因此使用了踝足矯形器。小纖維感官測試在庫存分布中略有下降。振動覺和本體感覺保持完好。有明顯的輕度不協(xié)調；快速手指運動緩慢，腳跟到脛骨測試受損。Romberg征陰性。神經傳導研究（表1) 顯示具有脫髓鞘特征的輕度感覺運動性多發(fā)性神經?。ㄟ\動傳導速度；20–25 m/sec；正常上肢≥50 m/sec，下肢≥40 m/sec）。感覺和運動神經振幅正常，但腓總神經 CMAP 振幅較低。隨著時間的推移，他的高弓足惡化，他的神經傳導研究顯示進行性脫髓鞘（潛伏期延長增加）和長度依賴性軸突喪失（運動和感覺振幅進行性喪失）的證據。15.5 歲時的眼底鏡檢查顯示廣泛的周邊視網膜萎縮伴中央黃斑（即嚴重的視桿細胞功能障礙伴視錐細胞相對保留）與色素性視網膜炎一致（圖 1)。視力正常。視覺誘發(fā)電位正常。暗視桿狀視網膜電圖 (ERG) 顯示輕度異常，表明周邊視網膜的桿狀細胞功能障礙。明視錐和 30 Hz 閃爍也異常，表明視錐功能障礙。在他 16.5 歲時的賊后一次臨床隨訪中，他在家中可以進行短距離走動，但由于他嚴重的共濟失調，長距離走動需要輪椅。他沒有表現(xiàn)出生長或青春期延遲的跡象。他的身高在 10-25百分位之間，并且在 16 歲時，他被注意到具有與年齡相適應的青春期發(fā)育；Tanner IV 陰毛和 12-15 mL 睪丸體積。他的認知、語言和視覺都完好無損。他沒有腎臟或肝臟受累的臨床或生化證據。
表1:神經傳導基因解碼

	正常	患者 1			患者 2
		就診年齡
		12年	13年	16年	13 ½ 年
運動：
正中神經
DML（手腕到 APB）	< 4.2		3.6	5.4	3.4
CMAP (毫伏)	≥3.9		9.2	4.1	8.6
CV（米/秒）	> 47		27	27	33
尺神經
DML（毫秒；手腕到 ADM）	< 3.4	2.6	3.1	3.6	2.2
CMAP (毫伏)	≥5.9	13.1	12.7	4.6	7.7
CV（米/秒）	> 47	25	27	23	24
脛神經
DML（毫秒；腳踝到 AH）	< 6.0	5.3	6.2	10.5	4.5
CMAP (毫伏)	≥3.9	3.3	3.6	0.5	6.6
CV（米/秒）	> 39	21	22	15	26
腓神經
DML（毫秒；腳踝到 EDB）	< 6.0	5.0		8.5	4.5
CMAP (毫伏)	≥ 2.4	1.7		0.8	2.9
CV（米/秒）	> 39	22		17	43
感官：
正中神經
PL（毫秒；手腕到手指-II）	< 3.2	2.5	2.8	3.4	2.1
SNAP (μV)	≥ 14	67	69	15	36
CV（米/秒）		46	39	40	52
尺神經
PL（毫秒；手腕到手指-V）	< 3.3	2.0	2.2	3.1	2.2
SNAP (μV)	≥ 9	43	64	26	44
CV（米/秒）		47	50	35	43
腓腸神經
PL（毫秒；小腿到拉特購物中心）	< 4.2	3.8	3.0	NR	2.7
SNAP (μV)	≥ 5	11	17	NR	9.5
CV（米/秒）		42	40	NR	35

圖1：患者 1 在 15.5 歲時的視網膜照片確定為色素性視網膜炎。觀察到廣泛的周邊視網膜萎縮，中央黃斑相對保留。臨床上這對應于外周視桿細胞的參與和視錐細胞的相對保留。

12 歲時腦部 MRI 顯示小腦萎縮（圖2). 在幾年的時間里進行了廣泛的基因檢測和代謝測試，包括正常PMP22重復/缺失分析基因檢測、MPZ、GJB1、PMP22和c10orf2基因檢測、脊髓小腦性共濟失調組（SCA 1、2、3、6、7、8、17 ), Friedreich 共濟失調重復基因檢測和血清維生素 E 水平。染色體微陣列基因檢測正常。肌肉活檢（15 歲時）顯示輕微的神經源性變化。肌肉呼吸鏈酶檢測正常。血漿腎上腺和睪丸性類固醇水平正常。

圖 2：腦部 MRI。患者 1 在 12 歲時進行了 MRI 檢查。T1W1 矢狀位圖像顯示小腦上葉和中葉有明顯的小腦萎縮。軸位圖像（未顯示）顯示皮質下和小腦白質正常。MR 波譜正常（未顯示）。16 歲時的重復 MRI 成像沒有變化（未顯示）。腦部 MRI（患者 2）顯示出相似的模式，但小腦萎縮較輕（未顯示）。

在家族史分析時，患者1的弟弟具有非常相似的特征?；颊叩母改浮⒔憬愣紱]有這種疾病。對血緣關系進行擴展調查，沒有發(fā)現(xiàn)其他患者。佳學基因親緣親系檢測證明，患者父母不是近親，沒有血緣關系。

病人 2

這位 14 歲的弟弟在 2 歲時被確診患有中度至重度感音神經性聽力損失，需要助聽器。他的早期神經發(fā)育正常。他仍然很活躍；賊后隨訪能夠滑冰 3 公里和越野滑雪 1-1.5 小時。他不需要踝足矯形器或任何其他輔助設備。他的檢查對非常輕度的高弓足和反射減退（二頭肌 1+、肱橈肌 1+、三頭肌 2+、髕骨 1+、踝反射 0）、屈肌底反應和輕度前間室無力（脛骨前肌 4+/5、腓骨肌）具有重要意義長肌 4+，拇長伸肌 4)。除了腳趾針刺感覺過敏外，感官測試正常。注意到輕微的腳踝緊繃。協(xié)調是正常的。神經傳導研究（表1) 顯示具有脫髓鞘特征的輕度感覺運動性多發(fā)性神經病。眼底檢查顯示廣泛的周邊視網膜萎縮，中央黃斑不受累。視力和 ERG 正常。他的認知完好無損，并且在常規(guī)課堂環(huán)境中取得了良好的學業(yè)成績。盡管他的身高一直低于第 5^個百分點，但他表現(xiàn)出正常的生長速度。在將近 14 歲的時候，他沒有顯示出陰毛初現(xiàn)的跡象，Tanner I 陰毛和 5 mL 睪丸體積。他的實際年齡為 13 歲 8 個月，骨齡為 11 歲，符合體質性生長和青春期延遲。他沒有顯示腎臟或肝臟受累的證據。

致病基因鑒定基因解碼基因檢測

佳學基因對兩兄弟的 DNA 進行了外顯子組捕獲和高通量測序。按照標準程序從血液中提取總基因組 DNA。使用 Agilent SureSelect 50Mb 全外顯子試劑盒進行外顯子組靶點富集，測序 (Illumina HiSeq) 為每個樣本生成 65 Gbp 的 100 bp 配對末端讀數(shù)。編碼序列區(qū)域 (CCDS) 的平均覆蓋率，在考慮重復讀取后，兩個人分別為 237 倍和 212 倍。患者 1 中 91.5% 的 CCDS 堿基和患者 2 中 90.0% 的 CCDS 堿基覆蓋率≥20 倍，兩個人中 96.8% 的 CCDS 堿基覆蓋率≥5 倍。內部注釋管道用于調用和注釋編碼和剪接位點變體。使用 Picard 標記并排除重復讀取。使用 SAMtools pileup和 varFilter調用單核苷酸變異和短插入和缺失 (indel)，并進行質量過濾以要求至少 20% 的讀數(shù)支持變異調用。使用 Annovar以及自定義腳本對基因突變序列進行注釋，以選擇編碼和剪接位點變體，并排除 NHLBI 外顯子組服務器中代表的常見（≥1% 次要等位基因頻率）多態(tài)性，與佳學基因所記錄的1000個對照外顯子組序列進行比對。根據在兩名受影響患者中發(fā)現(xiàn)的突變序列進行優(yōu)先排序。鑒于假定的常染色體隱性遺傳模式，僅考慮具有純合或多個雜合突變的基因。
突變序列的基因檢測驗證

Sanger 測序用于驗證下一代測序鑒定的突變，并評估家族中變異的分離。采集了血液樣本，并從患病的兄弟和未受影響的父母和姐妹身上提取了 DNA。使用引物5'-GAGTGGATAGGTTGAGAATGTCAGTG-3 ^'和5'-TTTAGACAGACAGCCTTAGTCGGG-3 ^'進行 PCR以測試 c.101C>T 變體和5'- ^{ACCAATAACCAGCCATGTTTCCT} -3 ^'和5' ^{- TCCTACCTTTCCATACCTTTGCAT} - 3 ^'以測試c.101C>T 變體.1547T>C 變體。

生化分析

成纖維細胞中的生化測試如所述進行（表2) 。

測試	單位	患者 1	病人 2	參考范圍
等離子體：
VLCFA濃度
C26:0 六烷酸	微克/毫升	0.220	0.270	0.23 ± 0.09*
C26/C22		0.021	0.012	0.01 ± 0.004*
C24/C22		0.918	0.967	0.84 ± 0.918*
植烷酸	微克/毫升	1.260	0.810	< 3.0
紫杉酸	微克/毫升	0.140	0.060	< 0.3
成纖維細胞：
過氧化氫酶免疫熒光		接近正常	普通的	普通的
VLCFA濃度：
C26:0濃度	μmol/g蛋白質	0.20	0.20	0.18 - 0.38
C24:0濃度	μmol/g蛋白質	6.52	6.79	7.76 - 17.66
C22:0濃度	μmol/g蛋白質	3.00	3.23	3.84 - 10.20
比例 C26:0 / C 22:0		0.07	0.06	0.03 - 0.07
比例 C24:0 / C 22:0		2.18	2.10	1.55 - 2.30
過氧化物酶體功能：
β-氧化（C16:0）	pmol / (mg 蛋白質 / 小時)	3876	5061	3330 - 7790
β-氧化（C26:0）	pmol / (mg 蛋白質 / 小時)	1290	1325	800 - 2040
β-氧化（鸚鵡螺酸）	pmol / (mg 蛋白質 / 小時)	157	248	790 - 1690
α-氧化（植烷酸）	pmol / (mg 蛋白質 / 小時)	38	45	28 - 95
D-雙功能蛋白活性：
水合酶	pmol / (mg 蛋白質 / 分鐘)	43	53	115 - 600
脫氫酶	pmol / (mg 蛋白質 / 分鐘)	2個	3個	25 - 300
免疫印跡：
舒張壓 79 kDa		痕跡	痕跡	當下
舒張壓 45 kDa		缺席的	缺席的	當下
舒張壓 35 kDa		±/−	±/−	當下

基因檢測中的全外顯子測序的突變位點驗證結果

外顯子組測序和變體驗證

在HSD17B4（表3). c.1547T>C 被發(fā)現(xiàn)在一個覆蓋率非常低的區(qū)域，在患者 2 的 8 個讀數(shù)中僅出現(xiàn) 2 個（變異質量為 18.4%），因此只有在他兄弟的兩個變異被注釋后才能通過目視檢查來識別. Sanger 測序證實兩兄弟中存在 c.1547T>C 和 c.101C>T突變。父親和母親各含有中一個突變的雜合子；c.1547T>C; p.Ile516Thr來自母親c.101C>T；p.Ala34Val來自父親（圖3）. SIFT 算法預測這兩種突變都是有害的（SIFT 得分分別為 0.03 和 0），并且采用 PolyPhen2預測也是破壞性的（HumDiv 得分分別為 0.999 和 0.997）。這兩種突變分別被判斷為致病性的；但是，以前從未見過它們的組合。
表3：過濾外顯子組測序的基因突變

具有錯義、無義、插入缺失或剪接變異的基因	6453
具有罕見突變的基因1	372
兄弟共有突變的基因	109
具有純合子/多個雜合子突變的基因	2 2

¹如果變異在 1000 個基因組數(shù)據庫、NHLBI 外顯子組服務器中具有 >0.01 的次要等位基因頻率 (MAF)，或者在我們中心測序的 435 個對照外顯子組中 >2 個出現(xiàn)，則變異被過濾掉。
² 2個基因分別為C16orf82和FAM83C；這些基因被拒絕作為候選基因，因為兩個對照樣本在 C16orf82 中具有相同的序列變體，而一個對照樣本在FAM83C中具有相同的序列變體。然后重新檢查兄弟姐妹共有的至少一個突變的 109 個基因，并確定了HSD17B4突變。由于覆蓋率低，第二個HSD17B4突變賊初并未在患者 2 中發(fā)現(xiàn)（假設僅存在 2/8 讀數(shù)，其變異質量為 18.4，低于我們的閾值 20）。
 
圖 3：Sanger測序和分離。( A ) DBP 缺乏家系譜系。X=變體；N=正常。( B ) 外顯子組測序鑒定的HSD17B4變體的Sanger 測序驗證。使用外顯子 2 和 18 側翼的引物擴增基因組 DNA 用于測序（引物序列見正文）。星號表示雜合突變。紅色 X = c.101C>T（p. Ala34Val）在 chr5:118792052。藍色 X = c.1547T>C（p. Ile516Thr）在 chr5:118860954。

生化分析

血漿中 VLCFA 和支鏈脂肪酸（鸚鵡螺酸和植烷酸）的水平正常（表2). 血漿二十二碳六烯酸 (DHA) 水平也正常。使用快原子轟擊電離質譜法分析尿液，未發(fā)現(xiàn)尿液膽汁酸分泌異常。遺傳代謝疾病實驗室的成纖維細胞研究顯示正常的 VLCFA 水平和正常的 C26:0 β-氧化，但鸚鵡螺酸 β-氧化活性降低（表2). 過氧化氫酶免疫熒光研究顯示過氧化物酶體染色在過氧化物酶體的數(shù)量和形態(tài)方面正常至接近正常（表2). 患者 1 中過氧化物酶體的大小略有增加。DBP 酶活性測量顯示水合酶和脫氫酶活性降低（表2). 免疫印跡上 DBP 蛋白的量減少（表2）。

前額高腭弓高囟門增大人中長眼距過寬肌張力減退還有癲癇是不是遺傳性DBP缺乏癥的討論

佳學基因對患有先前未確診的神經退行性疾病的兩個兄弟進行外顯子組測序并進行基因解碼基因檢測，檢測到 HSD17B4 基因中存在復合雜合突變 c.101C>T (p.Ala34Val) 和 c.1547T>C (p.Ile516Thr)，這兩個突變位點分別影響脫氫酶和水合酶結構域。這兩種錯義突變之前都有報道，但在這兩種情況下，第二個錯義突變都會影響另一個等位基因上的相同 DBP 結構域. 先進個案例是 p.Ala34Val 和 p.Phe237Ser 的復合雜合子；影響脫氫酶結構域的兩個突變導致 III 型 DBP 和孤立的脫氫酶缺陷。第二種情況是 p.Ile516Thr 和 p.Asn457Tyr 的復合雜合子；在這種情況下，兩種突變都發(fā)生在水合酶結構域內，導致 II 型 DBP 和孤立的水合酶缺陷。盡管這名 II 型 DBP 患者存活了 13.5 年以上，但認知和語言缺陷很明顯。

對于在佳學基因檢測的患者中觀察到的相對較輕的臨床表型，一個明顯的解釋是每個等位基因上只有一個結構域受到不太嚴重的突變的影響。臨床表型顯示毒性降低和生化測試表明正常的轉錄、翻譯和 DBP 酶正常輸入到完整的功能性過氧化物酶體中。后者得到了佳學基因檢測患者中觀察到的正常過氧化氫酶免疫熒光的支持，表明正常的過氧化物酶體生物發(fā)生和形態(tài)；在患有更嚴重的 DBP 缺乏癥的患者中未發(fā)現(xiàn)這一情況. 關于 p.Ala34Val 突變的影響的信息很少，分析表明脫氫酶結構域的殘留酶活性較低。p.Ile516Thr 位于水合酶亞基的二聚化界面，但并未有效消除二聚化，這意味著存在有殘留的活性。殘留水合酶活性（約正常下限的 40%）與免疫印跡上水合酶結構域缺失之間的明顯差異可能部分是由于 L-雙功能蛋白 (L-BP) 負責部分測量的水合酶活性，因為它可以將底物 THC:1-CoA 代謝為 (24 S ,25 S)-24OH-THC-CoA 的異構體，不能被 L-BP 的脫氫酶結構域進一步代謝。結果也可以部分地代表突變體 DBP 酶的結構改變和穩(wěn)定性的組合。賊后，兩組同源二聚體（水合酶和脫氫酶結構域）可能彼此具有某種物理和功能關系。一個結構域中的突變有可能改變另一個單元的功能和穩(wěn)定性，即使突變結構域（例如脫氫酶）與相鄰的野生型結構域（例如水合酶）形成二聚體。因此，這種酶的體內功能似乎比體外研究預測的更復雜。

盡管由單一酶缺陷引起的其他一些過氧化物酶體疾病可能會出現(xiàn)在成年期（既酰基輔酶 A 氧化酶 (ACOX) 缺乏癥和甾醇載體蛋白 X (SCPx) 缺乏癥，但尚未報道 DBP 缺乏癥。由于水合酶和脫氫酶活性均受到影響，佳學基因檢測的患者在當前的 DBP 缺陷分類下將被視為 I 型。然而，絕大多數(shù) I 型缺陷患者在編碼截短或不穩(wěn)定蛋白質的HSD17B4中有突變，導致嚴重的表型和較差的生存. 據佳學基因解碼分析，患者的輕度臨床和生化表型需要進行新的分類。因此，佳學基因致病基因鑒定基因解碼提出了一種新的 DBP 缺陷變體，命名為 DBP IV 型，這是由于復合雜合突變影響了 DBP 的兩個不同結構域，但與相對較溫和的臨床和生化表型相關。

《神經系統(tǒng)疾病的臨床表征與基因序列變化》新提出的 DBP 缺乏亞型（IV 型）也適用于賊近被診斷患有由HSD17B4 內的復合雜合突變引起的 Perrault 綜合征的兩姐妹，一個影響脫氫酶結構域，一個影響水合酶結構域，與佳學基因檢測的患者相似。在這種情況下，姐妹們相對較輕的表型表現(xiàn)為感音神經性耳聾、輕度智力障礙、感覺運動性多發(fā)性神經病、身材矮小和卵巢發(fā)育不全。外顯子組測序對于獲得該診斷也是必不可少的，但未報告包括 DBP 酶活性測量在內的完整生化測試。佳學基因的患者與這些姐妹的不同之處在于她們正常的智力和青春期發(fā)育（在哥哥身上）。

過氧化物酶體疾病的總發(fā)病率約為每 5,000 個新生兒中有 1 個，這些病例中的大多數(shù)都很嚴重，因此很容易確定。與之前報道的患者形成鮮明對比的是，這里分享的兩兄弟沒有表現(xiàn)出任何新生兒或嬰兒癥狀，而且他們繼續(xù)表現(xiàn)出正常的認知。他們緩慢的 DBP 缺乏臨床過程新穎允許對 DBP 患者進行系列電生理診斷性測試；跨越數(shù)年的臨床檢查和神經傳導研究（表 1) 記錄反映小腦和感覺神經功能障礙增加的協(xié)調性逐漸下降。進行性感覺運動性多發(fā)性神經病表現(xiàn)出均勻的傳導速度減慢，讓人聯(lián)想到許多遺傳性脫髓鞘性多發(fā)性神經?。ɡ?Charcot-Marie-Tooth1 型）。年長的兄弟（患者 1）不僅表現(xiàn)出進行性脫髓鞘（延遲增加和傳導速度減慢），而且還表現(xiàn)出進行性的、長度依賴性軸突損失的證據。將現(xiàn)成的外顯子組測序引入罕見病診所將導致識別出更多患有 DBP 缺陷較輕變異的患者，并將提高我們對這種疾病和其他疾病的表型譜和發(fā)病過程的理解。
 
 

(責任編輯：佳學基因)